Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH GM055360 per SLB e U54HD068157 di RGM. JMB è stata sostenuta dal T32 Genetica formazione di Grant presso l&#39;Università della Pennsylvania (GM008216).

Il protocollo STA-PUT prevede tre fasi: 1) Messa a punto di apparecchi e reagenti, 2) Preparazione della sospensione di cellule dai testicoli intere, e 3) il carico delle cellule, la sedimentazione, e la raccolta di frazioni. Quando è eseguita da un team di due ricercatori, il protocollo vogliono otto ore in media. 1. Impostazione del Apparatus STA-PUT (Figura 1) *** Apparecchi STA-PUT deve essere posto in un 4 ° C grande frigorifero o una cella che può ospitare anche un raccoglitore di frazioni, se si preferisce che metodo di raccolta. <ol><li> La sera prima (o almeno un paio d&#39;ore prima) di eseguire il metodo, lavare tutte le attrezzature (in particolare il vetro e tubi) e sterilizzare con il 70% di etanolo. Lasciare apparecchiatura asciutto completamente prima di assemblare l&#39;apparecchiatura come illustrato in Figura 1. </li><li> Fissare i due cilindri 2 L (Figure 1B e C) e la camera di carico cella ( <strong&gt; Figura 1A) alla piattaforma superiore e collegare il tutto con due piccoli pezzi di tubo con fascette stringi tubo. Bloccare tutte le provette chiuse. Sigillare il beccuccio sulla L cilindro più a destra 2. </li><li> Mettere una piccola ancoretta nella camera di caricamento cella (Figura 1A) e una ancoretta maggiore nel 2 L cilindro più a sinistra (Figura 1B) che conterrà il BSA 2%. </li><li> Posizionare la camera di sedimentazione 2 L sulla piattaforma (Figura 1D). Posizionare il deflettore metallico (Figura 1F) direttamente sopra l&#39;apertura nella parte inferiore della camera di sedimentazione (Figura 1D). Questo è fondamentale, come il deflettore evita vortex del liquido e la rottura del gradiente cella durante la raccolta delle frazioni. Mettere il coperchio sulla parte superiore della camera di sedimentazione. </li><li> Dopo l&#39;applicazione di una piccola quantità di grasso per vuoto a giunto smerigliato del rubinetto a tre vie (figura 1G), fissare il rubinetto sul fondo della SECamera dimentation, collegando i giunti a smeriglio del rubinetto e la camera di sedimentazione. </li><li> Collegare la camera a cella di carico (Figura 1A) a destra all&#39;uscita del rubinetto con la tubazione. Chiudere il rubinetto. </li><li> Collegare il tubo frazionamento cellulare alla presa sinistra del rubinetto. Il tubo frazionamento comprende un pezzo di tubo con una pipetta Pasteur di vetro collegato all&#39;estremità aperta. Un pezzo di tubo di diametro inferiore è attaccato alla estremità più stretta della pipetta di vetro. La pipetta stretta limita il flusso della sospensione cellulare durante frazione raccolta. Bloccare questo piccolo tubo nella parte inferiore. </li><li> Preparare 2 L Krebs (1x) tamponare il giorno dell&#39;esperimento (Tabella 1). Poi, preparare 550 ml 2% BSA in 1x Krebs, 550 ml 4% BSA in 1x Krebs, e 50 ml 0,5% BSA in 1x Krebs. Filtrare e raffreddare queste soluzioni a 4 ° C. </li><li> Versare la soluzione BSA 4% nel cilindro L right 2 (Figura 1C) e il 2% BSAsoluzione in sinistra 2 L cilindro (Figura 1B). Assicurarsi che non ci sono grandi bolle nel tubo che collega questi cilindri. </li><li> Versare tampone Krebs nella camera di caricamento delle cellule e riempire il tubo che collega questa camera con la camera di sedimentazione, assicurandosi che non ci siano grandi bolle, in quanto questi potrebbero disturbare il gradiente. Spremitura o sfogliando il tubo aiuta delicatamente per rimuovere le bolle. Assicurarsi che tutto il tampone Krebs è nel tubo e non nella camera di cella. </li><li> Lasciare una piccola quantità di tampone Krebs di fluire nella camera di sedimentazione e poi drenare quasi tutto il tampone nel tubo frazionamento cellulare per riempire il tubo e rimuovere eventuali bolle grandi. </li><li> Collocare il raccoglitore di frazioni direttamente sotto la camera di sedimentazione. Assicurarsi che tutti i tubi frazione sono a posto e coperti con pellicola trasparente per evitare la contaminazione. </li></ol> 2. Isolare le cellule della spermatogenesi da Testicoli interi <ol&gt; <li> Sezionare testicoli da circa 12 topi adulti (preferibilmente almeno otto settimane) e posto in tampone Krebs a ​​temperatura ambiente per lavare via tutto il materiale contaminante. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l&#39;utilizzo di topi di laboratorio ed è stato eseguito in conformità con le linee guida della University of Pennsylvania Institutional Animal Care ed uso comitato. </li><li> Aggiungere 45 mg di collagenasi a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo conico a destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche. </li><li> Decapsulate i testicoli in un piatto a parte contenente 8 ml di soluzione tampone Krebs, scartando la tunica albuginea e rilasciando i tubuli seminiferi. La tunica albuginea è la sottile membrana che circonda i tubuli seminiferi. I tubuli dovrebbero facilmente staccarsi dalla tunica albuginea. Per fare questo, fare un&#39;incisione nella tunica albuginea, tenere questa membrana con un pair di pinze, e spingere i tubuli fuori e lontano dalla membrana con un altro paio di pinze. </li><li> Aggiungere 4 ml di tampone Krebs contenente i tubuli in ogni provetta conica contenente 25 ml di soluzione di collagenasi e incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min. Alla fine, i tubuli dovrebbero avere un aspetto &quot;gli spaghetti-like&quot;. </li><li> Lasciare i tubuli di accontentarsi di ~ 5 minuti al fondo della provetta. Versare il surnatante e lavare 2x in 25 ml di tampone Krebs (a temperatura ambiente), permettendo tubuli di depositarsi sul fondo della provetta ogni volta. Lascia ~ 5 ml di soluzione tampone Krebs in ciascun tubo. </li><li> Mentre il lavaggio, aggiungere 30 mg di tripsina a 50 ml di soluzione tampone Krebs in un tubo falcon destra prima che si intende aggiungere i tubuli seminiferi. Lasciare questa soluzione per riscaldare fino a 33 ° C per pochi minuti. Diviso equamente in due provette da 50 ml coniche. </li><li> Aggiungere 25 ml di soluzione di tripsina per ciascuna delle due provette contenenti i tubuli. Aggiungere 3 g DNAsi (1 μg/10ml) a ciascun tubo per impedire cellas di aggregazione. Incubare, agitazione, a 33 ° C per 10 min. </li><li> Utilizzare una vasta pipetta foro per agitare la soluzione contenente i tubuli, li pipettaggio in e out di circa 10x. La soluzione dovrebbe cominciare a guardare più come una sospensione singola cella. </li><li> Incubare, agitazione, a 33 ° C per altri 10 min. Utilizzare una vasta pipetta foro per disperdere i tubuli in una sospensione singola cella, li pipettaggio in e out di circa 25x. Se si vede ancora un sacco di tubuli o grumi di cellule, disperdere più con la pipetta e / o aggiungere un altro 3 mg DNAse ad ogni provetta (doppia concentrazione iniziale). </li><li> Filtrare la sospensione singola cellula attraverso un colino cellula maglia 100 micron (una per ciascun tubo di sospensione cellulare 30 ml). Combinare le sospensioni cellulari e contare il numero totale di cellule (dovrebbe essere tra 7-8 x 10 8 cellule). *** NON caricare più di 800 milioni le cellule sul gradiente. </li><li> Sulla base del conteggio delle cellule ottenuto nella fase 2.10, pellet il appropril volume iate di cellule filtrate a 450 rcf per 5 minuti e lavare con 30 ml di tampone Krebs. Ripeti. *** Di solito 22 testicoli produrranno più di 800.000.000 di cellule, ma non caricare più di questo numero di celle. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule in 25 ml 0,5% BSA contenente tra 2,5 e 5 mg DNAsi (a seconda del grado di aggregazione delle cellule) senza creare bolle. Assicurarsi che le cellule non si aggregano. Filtrare la sospensione singola cella attraverso un colino cella di rete 100 micron. Le cellule sono ora pronti a caricare. Mescolare bene prima di caricare invertendo il tubo di un paio di volte. </li></ol> 3. Cella di carico e sedimentazione <ol><li> Assicurarsi che il rubinetto è chiuso, ma nella posizione che permetterà liquido di fluire dalla camera di cella (Figura 1A) nella camera di sedimentazione (Figura 1D). </li><li> Girare entrambe le piastre ancoretta a un livello basso (circa 70 giri) per consentire le barre stir di muoversi continuamente, ma lentamente. </li><li> Versare la sospensione cellulare nella camera di cella (Figura 1A) e aprire il rubinetto in modo che le cellule fluire lentamente nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min (Figura 1D). Chiudere il rubinetto. Portata può essere determinata marcatura intervalli volume sulla camera di sedimentazione. </li><li> Versare 5 ml di soluzione di BSA 0,5% nella camera di cella e di scarico nella camera di sedimentazione ad una velocità di 10 ml / min. Chiudere il rubinetto. Questo passaggio lavare le cellule dalla camera di cella. Ripetere 4x. </li><li> Preparare il gradiente: Aprire i ganci tra la camera a cella (Figura 1A) e le due cilindri 2 L (Figura 1B e C), e cominciare a drenare il liquido nella camera di sedimentazione ad una velocità di 40 ml / min (Figura 1D) immediatamente. Regolare la portata in modo che richiede circa 20-30 min per caricare il gradiente BSA nella camera di sedimentazione. Un sottile strato di cellule indisturbato situata sulla cima delBSA gradiente dovrebbe essere visibile. Una volta caricata la maggior parte della BSA, chiudere il rubinetto e girarlo nella posizione che vi permetterà di drenare il liquido dalla camera di sedimentazione nel tubo di frazionamento. </li><li> Spegnere le piastre mescolare. </li><li> Permettono alle cellule di sedimentare per un&#39;ora e 45 minuti. NON DISTURBARE &#39;APPARECCHIO durante questo tempo. Qualsiasi agitazione meccanica potrebbe disturbare il gradiente. </li></ol> 4. Frazionamento e analisi delle frazioni *** Come si eseguono le seguenti operazioni, fare attenzione a non disturbare il gradiente. Se il gradiente BSA è disturbato, la procedura non funzionerà! <ol><li> Una volta che le cellule si sedimentano, drenare lentamente 50 ml dalla camera di sedimentazione in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questa frazione di solito contiene grumi indesiderati di cellule e detriti. </li><li> Collegare il tubo frazione al collettore di frazioni. *** E &#39;anche possibile raccogliere frazioni da parte se un colle frazionector non è disponibile. </li><li> Raccogliere frazioni: Regolare il flusso con il rubinetto in modo che 10 ml (riempimento un tubo di raccolta) sono raccolti ogni 45 sec. </li><li> Tappare i tubi di raccolta frazione e girare per 5 minuti a 450 rcf a 4 ° C. Versare il surnatante delicatamente, risospendere le cellule in un liquido rimanente e mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Una volta che tutte le frazioni vengono raccolte, microscopicamente analizzare le frazioni di diverse popolazioni cellulari. Diversi tipi di cellule possono essere distinti in base alle dimensioni e la morfologia cellulare nucleare 8,15. Figura 2 illustra &quot;risultati rappresentativi&quot; per le tre frazioni raccolte che si arricchiscono per celle (a) e somatiche meiotiche e spermatogoni, (b) spermatidi rotondi, e (c) allungamento e condensazione spermatidi. <ul><li> Tipo A spermatogoni sono 12-14μm ca. di diametro e hanno nuclei rotondi che sono omogenea composizione cromatina. </li><li> Tipo B spermatogoni sono 8-9μm ca. di diametro e hanno ROUNd nuclei che mostrano più denso eterocromatina lungo la periferia nucleare. </li><li> Spermatociti Pre-leptotene sono 7.5-8.2μm ca. di diametro, hanno meno citoplasma di tipo B spermatogoni, e hanno nuclei che sembrano simili a quelle di tipo B spermatogoni. </li><li> Spermatociti primari leptotene sono 8-10 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti pre-leptotene, ma sembrano avere più denso cromatina a livello della membrana nucleare. </li><li> Zigotene spermatociti primari sono 10-12 micron ca. di diametro e hanno nuclei che sono simili a quelli di spermatociti primari leptotene. </li><li> Spermatociti pachitene sono ovunque 12-18 micron ca. di diametro e sono costituiti da un sottile bordo di citoplasma che circonda un nucleo di grandi dimensioni. Altre macchie di denso cromatina può essere visto nel nucleo. </li><li> Spermatidi rotondi sono 10 micron ca. di diametro e hanno un nucleo rotondo con chromocenter densamente colorazione nel mezzo. </li><li> Residuocorpi sono ~ 6.5 micron di diametro, sono rotondi, e mancano di un nucleo. </li><li> Allungamento e condensazione spermatidi sono simili per dimensioni a arrotondare spermatidi, ma hanno un unico nucleo a forma di falce. </li></ul><ol><li> Inizia con frazione di 15, e analizzare ogni cinque frazioni fino a 85. Di solito, le frazioni inferiori a 15 saranno troppo misto e disomogeneo, e le frazioni superiori a 85 conterranno pochi a nessun cellule utilizzabili. </li><li> Per analizzare una frazione, prendere 5UL di liquido dal tubo di raccolta delle frazioni (volta che le cellule sono state risospese dopo centrifugazione) e aggiungere 5UL dell&#39;8% formaldeide in tampone Krebs. Lasciare le cellule fissate a riposare a temperatura ambiente per cinque minuti. </li><li> Aggiungere 5UL del 0,1% Triton e DAPI (5 μ / ml tampone Krebs) alle cellule fisse. Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Trasferire 10 microlitri della soluzione risultante su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto e analizzare con un microscopio a fluorescenza per determinare la purezza di ciascuna frazione. </li><li> Unire le frazioni che sono simili per dimensioni e morfologia nucleare (vedi &quot;Rappresentante dei risultati&quot;) per creare le seguenti popolazioni di cellule: cellule diploidi meiotiche e somatiche, spermatidi rotondi e condensazione / allungamento spermatidi. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo protocollo essendo dimostrato prevede l&#39;utilizzo di topi di laboratorio ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Animali utilizzati in questo protocollo sono mantenuti sotto la guida e l&#39;approvazione della University of Pennsylvania Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (protocollo IACUC # 804284).

Coloro che studiano la spermatogenesi si basano su modelli animali per i campioni di cellule spermatogenesi, come un sistema di coltura cellulare affidabile non esiste ancora per generare tutti i tipi cellulari spermatogeniche 3. Anche se le cellule spermatogenesi sono prontamente raccolti dai testicoli intere, solo una popolazione mista risultati. Questo pone un problema per coloro che desiderano studiare specifici sottotipi di queste cellule, come le cellule meiotiche, spermatidi rotondi e spermatidi conden...

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli 1. In breve, staminali come gli spermatogoni che risiedono vicino l&#39;epitelio del tubulo seminifero divide e differenziarsi in spermatociti, che poi subiscono le divisioni meiotica. Dopo meiosi è completa, le cellule aploidi risultante o spermatidi rotondi, subiscono spermiogenesi, un processo di differenziazione che coinvolge lo spargimento del citoplasma e compattazione del nucleo. Spermatidi gradualmente sviluppano un flagello e subiscono l&#39;allungamento e la condensazione del nucleo, producendo allungamento e poi a condensazione spermatidi, rispettivamente. I prodotti finali sono spermatozoi, che vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero e infine nella epididimo dove maturano ulteriormente. Poiché il processo di spermatogenesi basa su condizioni ormonali e molecolari specialitesticoli, un sistema affidabile coltura in vitro per l&#39;intero processo di spermatogenesi non è ancora stato sviluppato 2,3. Metodi di coltura sono stati sviluppati per la creazione di &quot;cellule germinali primordiali come cellule&quot; e, &quot;le cellule spermatidi-come rotonde&quot; aploidi da cellule staminali, ma questi metodi non sono ancora in grado di generare un gran numero di queste cellule e non riescono a produrre più tardi cellule spermatogenesi Tipi 4,5. Fortunatamente, i tipi cellulari spermatogenici differenze significative delle dimensioni, che consente una cella singola sospensione ottenuta da testicoli interi da separare con un gradiente liquido. Il metodo STA-PUT, ha dimostrato qui, usa un gradiente BSA lineare e semplice sedimentazione per separare le cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e massa 6-9. Il metodo STA-PUT ha diversi vantaggi rispetto agli altri due metodi più utilizzati per separare i tipi di cellule spermatogenesi: FACS e elutriazione 10-13. L&#39;apparato STA-PUT richiede only diversi pezzi di cristalleria specializzati riuniti in una stanza fredda o grande frigorifero. Pertanto, è meno costoso rispetto all&#39;utilizzo di un cell sorter o un elutriator. Il metodo STA-PUT produce una maggiore quantità di cellule per tipo di cellula e testicolo che possono essere ordinati per FACS in un arco di tempo comparabile, sebbene la purezza di ciascuna popolazione cellulare non è così elevata come quelli ottenuti con FACS 11. Cell sorting utilizzando biglie magnetiche (magnetico cell sorting attivato, MACS) è stato recentemente impiegato con successo per l&#39;arricchimento di spermatogoni da una popolazione di cellule testicolari mista, ma è attualmente inadatto per separare spermatociti e spermatidi a causa della mancanza di conoscenza della superficie adeguatamente i marcatori 14. Un ulteriore vantaggio del metodo STA-PUT su FACS o MACS è la capacità di isolare cellule vitali adatto a cultura successiva perché, contrariamente alla maggior parte dei protocolli FACS, non richiede alcun DNA o altri tipi di colorazione. Per gli studi che richiedono lrendimenti arge di spermatogenesi tipi di cellule al ~ 90% di purezza, la STA-PUT è un metodo ideale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Spermatogenesi mammifero è un processo di differenziazione complesso che avviene in più fasi nei tubuli seminiferi dei testicoli. Attualmente, non esiste un sistema di coltura cellulare affidabile consentendo differenziazione spermatogenesi in vitro, e la maggior parte degli studi biologici di cellule spermatogenesi richiedono raccolta dei tessuti da modelli animali come il topo e nel ratto. Poiché il testicolo contiene numerosi tipi di cellule - sia non spermatogenesi (Leydig, Sertoli, mieloidi e cellule epiteliali) e spermatogenesi (spermatogoni, spermatociti, spermatidi rotondi, a condensazione spermatidi e spermatozoi) - Studi dei meccanismi biologici coinvolti nella spermatogenesi richiedono l&#39;isolamento e arricchimento di questi tipi di cellule differenti. Il metodo STA-PUT consente la separazione di una popolazione eterogenea di cellule - in questo caso, dai testicoli - attraverso un gradiente lineare BSA. Tipi di cellule individuali sedimentano con velocità di sedimentazione diversa a seconda cedimensioni ll, e le frazioni arricchito da diversi tipi di cellule possono essere raccolti e utilizzati in ulteriori analisi. Mentre il metodo STA-PUT non comporta frazioni altamente puri di tipi di cellule, ad esempio come possono essere ottenuti con determinati metodi di separazione delle cellule, esso fornisce un rendimento molto più elevato di cellule totali in ogni frazione (~ 1 x 10 8 cellule / tipo di cellula spermatogenesi da una popolazione iniziale di 7-8 x 10 8 cellule). Questo metodo alto rendimento richiede solo vetreria specializzata e può essere eseguita in qualsiasi ambiente freddo o grande frigorifero, che lo rende un metodo ideale per i laboratori che hanno accesso limitato alle attrezzature specializzate come una fluorescenza attivato cell sorter (FACS) o elutriator.

Il risultato ideale dalla procedura STA-PUT è abbastanza evidente separazione di cellule dai testicoli in base alle dimensioni e la densità delle cellule. Mentre le cellule isolate da testicoli sono sedimenta attraverso il gradiente BSA, si possono osservare diverse bande distinte di cellule. Eventuali grumi di cellule tendono a depositarsi sul fondo del gradiente e non contaminare le altre frazioni. Un po &#39;più in alto il gradiente sarà il grande somatiche e le cellule meiotico. Più in alto il gradiente sarà a...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.6K Views.  University of Pennsylvania.  Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità. 

Video: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Ricerca

Biologia

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel bayesiano Cambia punto di Algoritmo per Genome-wide analisi di diversi tipi di dati ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Separazione dei Ectoderma embrionali di topo viso e Mesenchima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Sviluppo di un sistema di inserimento co-coltura di due tipi cellulari in assenza del cellula-cellula di contatto

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...