1. Preparazione del gel <ol><li> Pesare la massa appropriato di agarosio in una beuta. Gel di agarosio sono preparati con p / v soluzione di percentuale. La concentrazione di agarosio in un gel dipenderà dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare, con la maggior parte gel comprese tra lo 0,5% -2%. Il volume del buffer non deve essere superiore a 1/3 della capacità del pallone. </li><li> Aggiungere tampone di corsa alla agarosio contenente pallone. Mescolare. Il gel più comune buffer di esecuzione sono TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) e TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Sciogliere l&#39;agarosio / buffer miscela. Questo è più comunemente fatto da riscaldamento in un forno a microonde, ma può anche essere eseguita su una fiamma Bunsen. A intervalli di 30 s, togliere i il contenuto della beuta e agitare bene. Ripetere fino l&#39;agarosio si è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere etidio bromuro (EtBr) ad una concentrazione di 0,5 ug / ml. In alternativa, il gel può anche essere tinta dopo elettrophoresis in esecuzione tampone contenente 0,5 mg / ml EtBr per 15-30 min, seguito da decolorazione in tampone di corsa per la stessa durata di tempo. </li></ol> Nota: EtBr è un sospetto cancerogeno e devono essere adeguatamente smaltite da regolamento dell&#39;istituzione. I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano gel contenenti EtBr. Coloranti alternativi per la colorazione del DNA sono disponibili, ma EtBr rimane il più popolare grazie alla sua sensibilità e il costo. <ol start="5"><li> Lasciare raffreddare agarosio sia sul piano del banco o da incubazione in un bagno di acqua 65 ° C. In caso contrario, sarà deformare la mascherina. </li><li> Collocare il vassoio gel nell&#39;apparato casting. In alternativa, si può anche fissare le estremità aperte di un vassoio gel per creare uno stampo. Inserire un pettine appropriato nello stampo gel per creare i pozzi. </li><li> Versare l&#39;agarosio fuso nello stampo gel. Lasciare il agarosio per impostare a temperatura ambiente. Rimuovere il pettine e posizionare il gel nella casella gel. In alternativa, la gel può anche essere avvolto nella pellicola e conservati a 4 ° C fino all&#39;uso (Fig. 1). </li></ol> 2. Approntamento delle apparecchiature Gel e separazione di frammenti di DNA <ol><li> Aggiungere colorante di caricamento dei campioni di DNA da separare (Fig. 2). Gel loading dye è tipicamente effettuata concentrazione 6X (0,25% blu di bromofenolo, cyanol xilene 0,25%, 30% glicerolo). Loading dye aiuta a tenere traccia di quanto il campione di DNA ha viaggiato, e permette anche il campione ad affondare nel gel. </li><li> Programma l&#39;alimentazione a tensione desiderata (1-5V/cm tra gli elettrodi). </li><li> Aggiungere tampone di corsa sufficiente a coprire la superficie del gel. È importante utilizzare lo stesso buffer esecuzione come quello utilizzato per preparare il gel. </li><li> Collegare i cavi della scatola gel alla rete elettrica. Accendere l&#39;alimentazione e verificare che sia casella di gel e l&#39;alimentazione stanno lavorando. </li><li> Togliere il coperchio. Lentamentee accuratamente caricare il campione di DNA (s) nel gel (Fig. 3). Un appropriato marcatore di dimensioni DNA dovrebbe sempre essere caricato con campioni sperimentali. </li><li> Sostituire il coperchio alla scatola gel. Il catodo (cavi neri) dovrebbe essere più vicino ai pozzi che l&#39;anodo (cavi rossi). Doppio controllare che gli elettrodi sono collegati alle apposite fessure nella sezione di alimentazione. </li><li> Accendere l&#39;alimentazione. Eseguire il gel fino a quando il colorante è migrata ad una distanza adeguata. </li></ol> 3. Osservando frammenti di DNA separati <ol><li> Quando elettroforesi ha completato, spegnere l&#39;alimentazione e rimuovere il coperchio della scatola gel. </li><li> Rimuovere il gel dalla scatola gel. Scolare il tampone in eccesso dalla superficie del gel. Collocare il vassoio gel su carta assorbente per assorbire eventuali buffer di più in esecuzione. </li><li> Rimuovere il gel dal vassoio gel e esporre il gel a luce UV. Questo è più comunemente eseguita utilizzando un sistema di documentazione gel (Fig. 4). Bande di DNA dovrebbe mostrarecome arancio bande fluorescenti. Scatta una foto del gel (Fig. 5). </li><li> Smaltire il gel e tampone di corsa da regolamento dell&#39;istituzione. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Figura 5 rappresenta un tipico risultato dopo elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR. Dopo la separazione, i frammenti di DNA risultanti sono visibili come bande chiaramente definiti. Lo standard o DNA ladder devono essere separati in una misura che consente la determinazione utile delle dimensioni delle bande del campione. Nell&#39;esempio illustrato, frammenti di DNA di 765 bp, 880 bp e di 1022 bp sono separati su un gel di agarosio 1,5% con un 2-log scala DNA. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig1.jpg" /> Figura 1. Un gel solidificato agarosio dopo la rimozione del pettine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig2.jpg" /> Figura 2. Uno studente l&#39;aggiunta di colorante carico ai suoi campioni di DNA. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig3.jpg" /> Figura 3. Uno studente caricamento del campione di DNA in un pozzo nel gel. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig4.jpg" /> Figura 4. Un esempio di un sistema di documentazione gel. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3923/3923fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;immagine di un posto elettroforesi su gel. EtBr è stato aggiunto al gel elettroforesi prima ad una concentrazione finale di 0,5 ug / ml, seguito da separazione a 100 V per 1 ora. Il gel è stato esposto a luce UV e la foto con un sistema di documentazione gel.

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	<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Kirkpatrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+agarose+gel+properties.">Overview of agarose gel properties.</a> Electrophoresis of large DNA molecules: theory and applications. , 9-22 (1991).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+endonuclease+R&#8226;EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis.">Analysis of endonuclease R&#8226;EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J. Virol. 14, 1235-1244 (1974).</li><li>Smith, S. B., Aldridge, P. K., Callis, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+individual+DNA+molecules+undergoing+gel+electrophoresis.">Observation of individual DNA molecules undergoing gel electrophoresis.</a> Science. 243, 203-206 (1989).</li><li>Aaji, C., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+electrophoresis+of+DNA.">The gel electrophoresis of DNA.</a> Biochim. Biophys. Acta. 269, 192-200 (1972).</li><li>Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+field+gel+electrophoresis.">Pulsed field gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 7, 34-42 (1989).</li><li>Devor, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDT tutorial: gel electrophoresis. , (2010).</li><li>Serwer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gels:+properties+and+use+for+electrophoresis.">Agarose gels: properties and use for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 4, 375-382 (1983).</li><li>Dea, I. C. M., McKinnon, A. A., Rees, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tertiary+and+quaternary+structure+and+aqueous+polysaccharide+systems+which+model+cell+wall+adhesion:+reversible+changes+in+conformation+and+association+if+agarose,+carrageenan+and+galactomannans.">Tertiary and quaternary structure and aqueous polysaccharide systems which model cell wall adhesion: reversible changes in conformation and association if agarose, carrageenan and galactomannans.</a> J. Mol. Biol. 68, 153-172 (1972).</li><li>Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+restriction+endonuclease+activities+in+H.+parainfluenzae+using+analytical+agarose-ethidium+bromide+electrophoresis.">Detection of two restriction endonuclease activities in H. parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis.</a> Biochemistry. 12, 3055-3063 (1973).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Elettroforesi su gel di agarosio ha dimostrato di essere un modo efficiente ed efficace di separare acidi nucleici. Elevata forza di gel di agarosio permette per la movimentazione di gel basse percentuali per la separazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni. Setacciatura molecolare viene determinata dalla dimensione di pori generati dai fasci di agarosio 7 nella matrice gel. In generale, maggiore è la concentrazione di agarosio, minore è la dimensione dei pori. Tradizionali gel di agarosio sono più efficaci alla separazione dei frammenti di DNA da 100 bp e 25 kb. Per separare frammenti di DNA più grandi di 25 kb, si dovranno usare elettroforesi su gel di impulsi di campo 6, che consiste nell&#39;applicazione di corrente alternata da due diverse direzioni. In questo modo i frammenti più grandi di DNA di dimensioni sono separati dalla velocità con cui si riorientare con i cambiamenti di direzione della corrente. Piccoli frammenti di DNA di 100 bp sono più efficacemente separati usando elettroforesi su gel di poliacrilammide. A differenza digel di agarosio, la matrice di gel di poliacrilammide è formato attraverso una reazione radicali liberi chimica condotta. Questi gel sono più sottili di una maggiore concentrazione, sono gestite in verticale ed avere una migliore risoluzione. Nella moderna sequenziamento del DNA elettroforesi capillare viene utilizzato, quale tubi capillari sono riempiti con una matrice di gel. L&#39;impiego di tubi capillari consente l&#39;applicazione di tensioni elevate, consentendo la separazione di frammenti di DNA (e la determinazione della sequenza di DNA) rapidamente. Agarose può essere modificato per creare fusione basso agarosio attraverso hydroxyethylation. Agarosio a bassa fusione viene generalmente utilizzata quando l&#39;isolamento di frammenti di DNA separati si desidera. Hydroxyethylation riduce la densità di impaccamento dei fasci di agarosio, riducendo le dimensioni dei pori 8. Ciò significa che un frammento di DNA della stessa dimensione avrà più di muoversi attraverso un gel di agarosio a bassa fusione rispetto a un normale gel di agarosio. Poiché i fasci associarsiattraverso interazioni non covalenti 9, è possibile rifondere un gel di agarosio dopo che è impostato. EtBr è il reagente più comune utilizzato per colorare DNA in gel di agarosio 10. Se esposto a luce UV, elettroni l&#39;anello aromatico della molecola etidio vengono attivati, che porta alla liberazione di energia (luce) come ritorno elettroni allo stato terra. EtBr funziona intercalando stessa nella molecola di DNA in maniera dipendente dalla concentrazione. Ciò consente una stima della quantità di DNA in una banda di DNA particolare sulla base della sua intensità. A causa della sua carica positiva, l&#39;uso del EtBr riduce il tasso di migrazione DNA del 15%. EtBr è un sospetto mutageno e cancerogeno, quindi si deve fare attenzione quando si maneggiano gel di agarosio che lo contengono. Inoltre, EtBr è considerato un rifiuto pericoloso e deve essere smaltito in modo appropriato. Macchie alternative per DNA in gel di agarosio sono SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet e blu metile. Di questi,Metile blu e Crystal Violet non richiedono l&#39;esposizione del gel di luce UV per la visualizzazione delle bande di DNA, riducendo così la probabilità di mutazione se il recupero del frammento di DNA dal gel è desiderata. Tuttavia, la loro sensibilità è inferiore a quello di EtBr. SYBR oro e SYBR green sono entrambi molto sensibili, coloranti uv dipendenti con minore tossicità rispetto EtBr, ma sono notevolmente più costosi. Inoltre, tutti i coloranti alternativi o non può essere o non funzionano bene quando aggiunto direttamente al gel, il gel pertanto dovrà essere tinto posto dopo elettroforesi. A causa dei costi, facilità d&#39;uso e sensibilità, EtBr rimane ancora la tintura di scelta per molti ricercatori. Tuttavia, in determinate situazioni, come ad esempio quando lo smaltimento dei rifiuti pericolosi è difficile o quando i giovani studenti eseguono un esperimento, un colorante meno tossico può essere preferito. Caricamento dei coloranti utilizzati in elettroforesi su gel risponde a tre obiettivi principali. In primo luogo si aggiunge la densità al campione, Permettendo così di sprofondare nel gel. In secondo luogo, i coloranti fornire colore e semplificare il processo di caricamento. Infine, i coloranti muovono a velocità standard attraverso il gel, consentendo la stima della distanza che frammenti di DNA sono migrati. Le dimensioni esatte di frammenti di DNA separati può essere determinata tracciando il logaritmo del peso molecolare per diverse bande di DNA standard contro la distanza percorsa da ciascuna banda. Lo standard DNA contiene una miscela di frammenti di DNA di predeterminate dimensioni che possono essere confrontati con i campioni di DNA sconosciuti. È importante notare che diverse forme di DNA muovono attraverso il gel a velocità diverse. DNA plasmidico superavvolto, a causa della sua conformazione compatta, si muove attraverso il gel più veloce, seguito da un frammento di DNA lineare della stessa dimensione, con la forma circolare aperta viaggiare più lenta. In conclusione, dopo l&#39;adozione di gel di agarosio in 1970 per la separazione del DNA, hadimostrato di essere una delle tecniche più utili e versatili ricerca scienze biologiche.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome di reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> I agarosio </td><td> Amresco </td><td> 0710 </td><td></td></tr><tr><td> Acido borico </td><td> Sigma </td><td> B7901 </td><td></td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di etidio </td><td> Sigma </td><td> E7637 </td><td> Cancerogeno-ha bisogno di essere smaltiti come rifiuti pericolosi </td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> Pescatore </td><td> BP2401-212 </td><td> Corrosivo </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> G33-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xilemae cyanol FF </td><td> Sigma </td><td> X4126 </td><td></td></tr><tr><td> Tris di base </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Investigator / FX gel documentazione del sistema </td><td> Fotodyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Owl Easycast B1 mini sistema di elettroforesi su gel </td><td> Thermo Scientific </td><td> B1-PTM </td><td></td></tr><tr><td> EPS 301 alimentazione </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments

Elettroforesi su gel di agarosio è il modo più efficace per separare frammenti di DNA di dimensioni variabili da 100 bp a 25 kb 1. Agarosio è isolato dalle alghe generi Gelidium e Gracilaria, e consiste di agarobiose ripetute (L-galattosio e D-) subunità 2. Durante la gelificazione, polimeri agarosio associano in modo non covalente e formare una rete di fasci cui pori formati determinare proprietà molecolari setacciatura di un gel. L&#39;uso di elettroforesi su gel di agarosio rivoluzionato la separazione del DNA. Prima dell&#39;adozione di gel di agarosio, il DNA è stato principalmente separati impiegando densità centrifugazione gradiente di saccarosio, che ha fornito solo un&#39;approssimazione di dimensioni. Per separare DNA usando elettroforesi su gel di agarosio, il DNA viene caricato in prefabbricati pozzetti nel gel e una corrente applicata. Lo scheletro di fosfato del DNA (e RNA) molecola è caricato negativamente, quindi quando posti in un campo elettrico, frammenti di DNA migrerà al positively carica anodo. Poiché il DNA ha una massa uniforme / carica rapporto, molecole di DNA vengono separati da una dimensione in un gel di agarosio in uno schema tale che la distanza percorsa è inversamente proporzionale al log del suo peso molecolare 3. Il modello importante per il movimento DNA attraverso un gel di agarosio è &quot;polarizzato reptation&quot;, per cui il bordo si muove in avanti e tira il resto della molecola lungo 4. La velocità di migrazione di una molecola di DNA attraverso un gel è determinata dalla seguente: 1) dimensione della molecola di DNA; 2) concentrazione di agarosio; 3) DNA conformazione 5; 4) tensione applicata, 5) presenza di bromuro di etidio, 6) Tipo di agarosio e 7) tampone di elettroforesi. Dopo la separazione, le molecole di DNA possono essere visualizzati sotto luce UV dopo colorazione con un colorante appropriato. Seguendo questo protocollo, gli studenti dovrebbero essere in grado di: <ol><li> Comprendere il meccanismo mediante il quale vengono separati frammenti di DNA all&#39;interno di una matrice gel </li><li> Capire come conformazione delMolecola di DNA a determinare la sua mobilità attraverso una matrice di gel </li><li> Identificare una soluzione di agarosio di concentrazione adeguato alle loro esigenze </li><li> Preparare un gel di agarosio per elettroforesi su campioni di DNA </li><li> Sistemare il dispositivo di elettroforesi su gel e alimentazione </li><li> Selezionare una tensione appropriata per la separazione di frammenti di DNA </li><li> Comprendere il meccanismo attraverso il quale permette di bromuro di etidio per la visualizzazione delle bande di DNA </li><li> Determinare le dimensioni dei frammenti di DNA separati </li></ol>

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Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

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Research

JoVE Journal

Biology

759.7K Views.  University of California Los Angeles. Un protocollo di base per la separazione di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio descritto.

Video: Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Denaturazione gel elettroforesi gradiente (DGGE)

Ricerca

Biologia

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Ottimizzato fibrina Gel Bead Assay per lo studio della angiogenesi

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

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Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

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SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Lo screening per aggregazione amiloide di semi-denaturazione detergente-Agarosio elettroforesi su gel

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Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturazione Urea elettroforesi su gel poliacrilammide (PAG Urea)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Electroeluting DNA Fragments

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a previous electrophoresis of the DNA fragments in order to separate the band of interest. Then, this band is excised out from an agarose or acrylamide gel and purified by using either: binding and elution from glass or silica particles, DEAE-cellulose membranes, "crush and soak method", electroelution or very often expensive commercial purification kits. Thus, selecting a method will depend mostly of what is available in the laboratory. The electroelution procedure allows one to purify very clean DNA to be used in a large number of applications (sequencing, radiolabeling, enzymatic restriction, enzymatic modification, cloning etc). This procedure consists in placing DNA band-containing agarose or acrylamide slices into sample wells of the electroeluter, then applying current will make the DNA fragment to leave the agarose and thus be trapped in a cushion salt to be recovered later by ethanol precipitation.

This procedure allows the purification of DNA fragments with high yield.

Electroeluting frammenti di DNA

Purified DNA fragments are used for different purposes in Molecular Biology and they can be prepared by several procedures. Most of them require a ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...