Ringraziamo Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson per aver letto con attenzione il manoscritto. Gli autori hanno ricevuto finanziamenti che è stato fornito dal Ministero della Ricerca MIWF dello stato Nord Reno-Westfalia (SR), il BMBF-Projekträger DLR collaborazione USA-tedesco in neuroscienze computazionali (CRCNS, SR), Centri di Eccellenza nelle malattie neurodegenerative (COEN; SR), e l&#39;Università di Bonn programma di finanziamento intramurale (BONFOR; SR).

1. Requisiti di sistema <ol><li> Sistema microscopio: buona visualizzazione del dendrite è cruciale. Se disponibile, utilizzare un sistema di microscopio a scansione laser a due fotoni. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato un ambito TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, in Germania o in un sistema di Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin dotato di Ti: Sapphire ultraveloce-laser pulsato (Chameleon Ultra II, coerenti) e un obiettivo di alto NA (60X, 0.9 NA, Olympus) per visualizzare le dendriti che avevamo riempito con un colorante fluorescente tramite la pipetta di patch. Sebbene foto-danneggiamento è pensato per essere meno grave utilizzando la scansione 2-fotone, ridurre la potenza del laser (di seguito 8 mW a tessuto) ei tempi di sosta (sotto di 1 msec), o il più possibile. </li><li> Una seconda possibilità è quella di attivare un largo campo sorgente luminosa a fluorescenza (LED o una lampada fluorescente) sincrono con acquisizione di ridurre il tempo di esposizione il più possibile. Abbiamo utilizzato un monocromatore con una fonte di luce integrata (TILLPhotonici, Gräfelfing, Germania) su una Zeiss Axioskop 2 FS microscopio verticale che era dotata di Dodt contrasto di illuminazione a infrarossi (TILLPhotonics, Gräfelfing, Germania). Nei nostri esperimenti tempi di esposizione variano da solitamente 10 msec a max. 30 msec. </li><li> Utilizzare un amplificatore micro-ionoforesi veloce, ad esempio un sistema di micro-ionoforesi due canali MVCS-C-02 (NPI elettronica, Tamm, Germania) con compensazione capacità veloce. I microelettrodi ionoforesi punta fine hanno resistenze di 25-100 MW (fondamentalmente a seconda della dimensione della punta e la forma della pipetta), e tempi di salita rapidi possono essere raggiunti solo se la compensazione capacità dell&#39;amplificatore iontoforetica è sintonizzato in modo ottimale. Questa compensazione veloce è necessario applicare impulsi di corrente con un breve e rapido inizio nel range sub-millisecondo alla pipetta iontoforetica e quindi per espellere il trasmettitore con alta risoluzione spaziale in formati di punto sotto 1 um 13. Amplificatori ionoforesi sono alcosì disponibile da diverse altre aziende, che non abbiamo testato nel nostro laboratorio. Questi dispositivi sono a nostra conoscenza non dotati di circuiti di compensazione capacitanza. </li></ol> 2. Preparare le soluzioni di <ol><li> Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione interna come è richiesto per la progettazione sperimentale. L&#39;unica aggiunta della soluzione interna, che è richiesto, è un colorante fluorescente rosso o verde (es. 50 a 200 pM Alexa Fluor 488 o 594 idrazide, Invitrogen), secondo il componente ottico. Qui un esempio per ACSF saccarosio che può essere utilizzato per la dissezione, in mM: NaCl 60, ​​100 saccarosio, 2.5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 1 CaCl 2, 5 MgCl 2, 20 glucosio, e per il normale ACSF soluzione per esperimenti di patch-clamp in mm: 125 NaCl, KCl 3, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl 2, 1.3 MgCl2, 15 glucosio. </li><li>Carbogenize (95% O 2, 5% di CO 2) tutte le soluzioni extracellulari costantemente. </li><li> Preparare soluzione interna, per esempio, in mM: 140 K-gluconato, 7 KCl, HEPES 5-acido, 0.5 MgCl2, 5 fosfocreatina, 0.16 EGTA, con 50-200 mM Alexa 488. </li><li> Per glutammato micro-ionoforesi preparare una soluzione con 150 mM di acido glutammico e regolare il pH a 7,0 con NaOH. Aggiungere 50 -200 micron Alexa Fluor 488 o 594 hydrazide (Invitrogen) per la visualizzazione. </li><li> Per ionoforesi del GABA preparare una soluzione 1 M GABA e regolare il pH a 5 con HCl 15. A questo pH GABA è carica, solo allora può essere applicato mediante iontoforesi. Si ricorda che il basso pH nella soluzione espulso nello spazio extracellulare potrebbe effetto trasmissione GABA sé 16,17. Proteggere la soluzione GABA dalla luce e spesso preparare fresco soluzione madre GABA, in quanto soluzione più vecchio può perdere la sua efficacia. </li><li> Se è difficile vedere gli eventi GABAergici, un high Cl - driving soluzione interna forza, per esempio lasciando fuori KCl, potrebbe aiutare a visualizzare gli eventi GABAergici per vedere se la ionoforesi GABA sta lavorando, ma per indagare l&#39;integrazione sinaptica una forza motrice fisiologico potrebbe essere raccomandato. Per il rilevamento generale di piccoli eventi GABAergici, un protocollo illustrato nella Figura 8C può aiutare. </li></ol> 3. Tirare e testare i Pipettes ionoforesi <ol><li> In generale, tirando le pipette giuste è forse la fase più critica per ottenere neurotrasmettitore ionoforesi controllata. Quando si utilizza ionoforesi in coltura cellulare, è possibile tirare molto fini elettrodi simili a microelettrodi taglienti 10. In esperimenti di patch-clamp in fettine acute, tuttavia, queste pipette molto sottili si piegano sulla superficie fetta quando vengono calate in tessuto con un angolo, il che rende impossibile raggiungere dendriti più profondi. </li><li> Pertanto, tirare una pipetta con una punta molto piccola, in modo che nessuna neurotransmitter può fuoriuscire, ma la punta deve essere ancora abbastanza rigida per penetrare nel tessuto (Figura 2). Ad esempio, utilizzare 150 GB F 8P pipette di classe (Science Products, HOFHEIM, Germania), e un estrattore orizzontale (ad esempio un estrattore DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, in Germania, o di un P-97 Puller, Sutter Instrument Company , Novato, CA) con varie fasi tirando per ottenere una piccola apertura, ma anche a breve maschiatore con un angolo ripido (Figura 2 e Tabella 2). </li><li> È anche possibile utilizzare pipette di vetro di quarzo di tirare pipette iontoforesi 10. Queste dovrebbero avere migliori proprietà meccaniche e di essere più affidabile, ma estrattori laser speciali sono necessari. Ma è anche possibile ottenere buoni risultati con pipette di vetro normali, che di solito vengono utilizzati per tirare pipette di patch. </li><li> Verificare le prestazioni e la resistenza pipetta in una camera senza tessuto, prima di usarli per la primatempo, poiché fuoriuscita di glutammato potrebbe danneggiare il tessuto. </li><li> Impostare l&#39;amplificatore ionoforesi correttamente. Poi riempire la pipetta con il neurotrasmettitore e colorante soluzione contenente e metterlo nella vasca da bagno (ACSF). </li><li> Compensare la capacitanza (Figura 3). Di solito pipette molto tagliente avranno una capacità maggiore di quelli contundenti. </li><li> Verificare la resistenza della pipetta: L&#39;amplificatore micro-ionoforesi qui utilizzato ha un accumulo in funzione per misurare la resistenza pipetta. Evoca brevi impulsi di prova rettangolari, che possono essere monitorati con un oscilloscopio standard o una scheda A / D collegato a un computer con il software di acquisizione. A seconda della forma e delle dimensioni punta, la punta dovrebbe avere una resistenza tra 25-90 MW. </li><li> Focus sulla punta con un obiettivo ad immersione in acqua 60X o 40X e passare l&#39;imaging a fluorescenza e, se possibile, lo zoom in Se fluorescenti perdite colorante fuori della punta della pipetta, applicare una piccola positivo (nel caso di glutamate) o negativo (nel caso del GABA, figura 4) mantengono corrente (&lt;0,02 μA). Se questo non aiuta ad annullare le perdite, cambiare la pipetta. </li><li> Applicare una forte corrente passo o utilizzare il trigger manuale e monitorare la punta nell&#39;immagine fluorescente per vedere se la soluzione può essere espulso dalla pipetta. Come menzionato sopra, la polarità dell&#39;impulso di corrente dipende dalla carica della molecola che dovrebbe essere espulso. Per espellere glutammato è una corrente negativa e per GABA una corrente positiva (Figura 4). </li><li> Le bolle d&#39;aria nella pipetta quel blocco espulsione di colorante e trasmettitore, possono essere cancellati mediante l&#39;applicazione di un alto espulsione corrente più volte. </li><li> Presi insieme, se non vi siano perdite visibili ed espulsione test ha avuto successo, compensare la capacitanza e iniziare l&#39;esperimento. </li><li> Attenzione: Poiché la compensazione capacitanza viene raggiunto da un circuito di retroazione, questo circuito può oscillare overshoot o se è overcompensated. Utilizzare con cautela la impostazione di selezione per la compensazione di capacità. </li><li> A seconda della stabilità estrattore a volte è necessario regolare le impostazioni estrattore di volta in volta, in quanto il filamento potrebbe essere cambiato proprietà. Tuttavia, se una volta che una buona pipetta è progettato, può essere utilizzato per diversi giorni. Pertanto, dopo aver terminato l&#39;esperimento memorizzare la pipetta Iontoforetico in un contenitore chiuso senza danneggiare la punta. </li><li> Per il prossimo esperimento riempire la pipetta con la soluzione di neurotrasmettitore, applicare più forti impulsi di espulsione per rimuovere la punta e poi verificare se le proprietà (per esempio resistenza) cambia in modo significativo. Poi compensare la capacitanza e utilizzare nuovamente la pipetta. Non utilizzare un solo pipetta con soluzioni differenti neurotrasmettitori. </li></ol> 4. Preparare le Fette cervello <ol><li> Se il micro-ionoforesi è utilizzata per la prima volta sicuramente preparare le fette dopo che istituisce un programma estrattore di lavoro affidabile. </li> &lt;li&gt; eseguire l&#39;anestesia e la decapitazione procedure in conformità alle linee guida per la cura degli animali del vostro istituto o ente locale. </li><li> Dopo la rimozione del cervello, trasferirla a ghiaccio freddo ACSF saccarosio (vedi 2.1 Protocol). </li><li> Tagliare la regione di interesse in fette di spessore adeguato (per esempio 300 micron). </li><li> Incubare le fette in ACSF saccarosio a 35 ° C per 30 min. In seguito, trasferirli su una camera di contenimento sommersa contenente ACSF normale a temperatura ambiente. </li><li> Tutta la preparazione e l&#39;esperimento carbogenize ACSF circonda le fette con 95% O 2, 5% di CO 2. </li></ol> 5. Stabilire una registrazione Whole-cell <ol><li> Posizionare la pipetta iontoforesi (s) già vicino la superficie fetta prima patch una cella, per evitare il posizionamento di lunga durata, dopo aver stabilito la modalità a cellula intera. </li><li> Tirare una resistenza bassa toppa pipetta (3-5 MW), riempirlo con il dye contenente soluzione interna e applicare pressione positiva alla pipetta (30 - 60 mbar). </li><li> Inserisci il bagno e l&#39;approccio alla cella sotto guida visiva (contrasto Dodt infrarossi o due di contrasto immagine gradiente fotone). </li><li> Monitorare la resistenza pipetta con un impulso di prova (ad esempio -10 mV, 20 msec) in modalità morsetto di tensione. Quando si tocca il tessuto correggere il potenziale di offset. </li><li> Avvicinarsi alla cella e premere delicatamente la punta della pipetta in esso fino a quando un &quot;fossetta&quot; può essere visto chiaramente. Rilasciare immediatamente la pressione della pipetta, applicare 40 - 60 mbar pressione negativa e commutare il potenziale di membrana a -65 mV. </li><li> Quando la corrente di mantenimento raggiunge valori inferiori a 100 pA, rilasciare la pressione negativa. </li><li> Dopo aver stabilito un sigillo giga (resistenza&gt; 1 GΩ), la rottura della membrana con una breve e forte aspirazione alla pipetta o breve sovracompensazione del circuito di compensazione capacità. </li><li> A seconda del modo (morsetto di tensione o corrente) è richiestoper il disegno sperimentale, compensare adeguatamente. </li><li> Iniziare a portare la pipetta Iontoforetico nella sua posizione finale. Se è necessaria una descrizione più dettagliata di come eseguire correttamente le registrazioni di patch clamp, ci sono diversi ottimi linee guida disponibili 18,19. </li></ol> 6. Posizionare la pipetta Iontoforetico e generare un potenziale Iontoforetico Postsynaptic <ol><li> In generale, gli eventi iontoforesi possono essere evocate in punti specificati seconda dell&#39;esperimento desiderato, per esempio, ad un dendrite spinosa per glutammato micro-ionoforesi, sull&#39;albero dendritico, soma o assone segmento iniziale per GABA micro-ionoforesi. </li><li> Avvicinarsi alla cella fino a circa 1 micron distanza senza toccarlo. Dopo aver raggiunto la posizione di interesse è fondamentale che non siano perdite di neurotrasmettitore e che la capacità pipetta viene compensata correttamente. </li><li> Se si avvicina la cella con un glutammato riempito pipett Iontoforeticoe provoca depolarizzazione rilevabile del potenziale di membrana, regolare la corrente conservano se possibile, o cambiare la pipetta. </li><li> Applicare brevi impulsi di corrente negativi, partendo da zero e aumentare la corrente sistematicamente (es. 0,1 - 0,4 msec, 0,01-1 μA impulsi). Questo aiuta a scoprire in cui l&#39;intervallo di corrente Iontoforetico evoca le risposte desiderate nella specifica configurazione sperimentale. </li><li> Se non vi è alcuna risposta rilevabile, sollevare la pipetta diverse centinaia di micrometri e applicare una forte corrente di espulsione (&gt; 0,1 μA) per pulire la punta. Regolare la compensazione capacità, avvicinarsi alla cella, e riprovare. </li><li> Se non vi è ancora alcuna risposta, ridurre la corrente di trattenere. State molto attenti con le impostazioni di chiamata in quanto questa procedura può causare la fuoriuscita incontrollata di neurotrasmettitore. Pertanto, monitorare costantemente il controllo per rilevare rispettive variazioni nel potenziale di membrana. </li><li> Se è difficile rilevare eventi GABAergici, può essere utile utilizzare unn composizione soluzione interna cedendo in un&#39;alta Cl - forza motrice. Per raggiungere questo, ridurre il Cl - concentrazione nella soluzione di pipetta (vedi sezione protocollo 2.6.). Questo si tradurrà in maggiori eventi GABAergici a potenziale di riposo di membrana dovuto ad una forza di guida superiore. </li><li> In alternativa, iniettare passi attuali lunghi con conseguente potenziale di membrana probabilità da -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Con questo protocollo il Cl - forza motrice viene aumentata a potenziali iperpolarizzati causando una risposta GABA depolarizzante. </li><li> È anche possibile utilizzare il protocollo di iniezione di corrente passo per determinare il potenziale di inversione degli eventi evocati, che contribuisce a determinare la natura GABAergica degli eventi. Perdita di GABA è più difficile da rilevare rispetto fuoriuscita di glutammato. In questo caso, un monitoraggio costante della resistenza di ingresso può aiutare, quando la pipetta riempita GABA si avvicina. Se la resistenza di ingresso diminuisce, il mantenere attuale può be aumentato o una pipetta differente deve essere usato. </li><li> Come esperimenti di controllo per ionoforesi glutammato, suggeriamo un esperimento di Ca 2 + di imaging, utilizzando 200 micron OGB-1 e non EGTA nella soluzione di pipetta di visualizzare l&#39;influsso di calcio locale che potrebbe essere causato da emissioni di glutammato. </li><li> In generale, per ottenere una risposta stabile è molto importante avere una pipetta meccanicamente stabile per evitare deriva nel tempo. Drift può essere causato da variazioni di temperatura, pertanto si consiglia di accendere l&#39;apparecchio, almeno mezz&#39;ora prima che le misure per evitare la deriva termica. Assicurarsi di utilizzare buone guarnizioni della cartuccia nel supporto pipetta e la punta è davvero risolto. Il titolare della stessa può essere ulteriormente fissato con nastro di teflon, inoltre, assicurarsi che non vi sia tensione sui cavi dal headstage o manipolatore, che è anche una potenziale fonte di deriva. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474, 100-104 (2011).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui spieghiamo come applicare velocemente micro-ionoforesi di neurotrasmettitori per indagare l&#39;integrazione sinaptica su dendriti. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per indagare trasmissione sinaptica glutamatergica e GABAergica in differenti regioni cerebrali in vitro e in vivo 9,20-22. Micro-ionoforesi è stato utilizzato per più di 60 anni, ma nei primi anni è stato in gran parte utilizzato per applicare sia a livello locale neurotrasmettitori e farmaci su tempi lenti...

Neuroni nel sistema nervoso centrale ricevono una varietà di input sinaptici sul loro processi dendritici sottili e ramificate 1. Lì, la maggioranza degli ingressi eccitatori dendritiche sono mediate da sinapsi glutamatergiche. Queste sinapsi possono essere attivati ​​in modo spazialmente distribuito, con conseguente integrazione lineare postsinaptica dei potenziali post-sinaptici eccitatori (EPSPs). Se le sinapsi vengono attivati ​​contemporaneamente e in prossimità spaziale sul dendrite, questi ingressi eccitatori possono essere integrati sovra-lineare e generano picchi dendritica 2-5. Inoltre, l&#39;integrazione di ingressi eccitatori dipende dalla posizione dell&#39;ingresso sull&#39;albero dendritico. I segnali che arrivano alla regione ciuffo distale sono molto più attenuate rispetto ingressi prossimale a causa di filtraggio cavo 6. Nell&#39;ippocampo, ingressi lontane verso le dendriti apicali ciuffo sono generati da una regione del cervello differente rispetto a quelli su prossimale dendriTES 7. Una domanda interessante è quindi, come ingresso sinaptica viene elaborato da diversi compartimenti dendritici e se l&#39;integrazione dendritica regola l&#39;influenza di questi ingressi a strati su neuronale in modi diversi. Non solo le proprietà funzionali, le caratteristiche morfologiche del dendrite, la posizione e il clustering degli ingressi stanno interessando l&#39;integrazione dendritica di input eccitatori, anche gli ingressi inibitori aggiuntivi da terminali GABAergici cruciale determinare l&#39;efficacia delle sinapsi glutamatergiche 8,9. Questi diversi aspetti dell&#39;integrazione sinaptica possono essere idealmente studiati usando neurotrasmettitore micro-ionoforesi, che permette l&#39;applicazione spazialmente definita di diversi neurotrasmettitori a domini dendritiche. Dimostriamo qui come stabilire con successo micro-ionoforesi di glutammato e GABA per indagare l&#39;integrazione del segnale nei neuroni. Per questa applicazione, a punta finealta resistenza pipette riempite con soluzioni concentrate neurotrasmettitori vengono utilizzati. Queste pipette sono posizionati vicino alla membrana esterna della cellula, dove si trovano i recettori dei neurotrasmettitori. È necessaria una buona visualizzazione dei rami dendritici. Ciò si ottiene utilizzando coloranti fluorescenti, che vengono introdotti attraverso la pipetta di patch. Poi un brevissimo (&lt;1 msec) impulso di corrente (nell&#39;intervallo di 10-100 nA) viene utilizzata per espellere le molecole del neurotrasmettitore cariche. Con queste brevi impulsi rapidi ed efficaci alle capacità, potenziali post-sinaptici o correnti possono essere evocate con alta precisione temporale e spaziale, il che significa che la posizione del input eccitatorio sia noto con precisione. Glutammato micro-ionoforesi può attivare sinapsi in un raggio definito, che è più piccolo di 6 ìm come qui mostrato (Figura 1 9), ma è anche possibile raggiungere sola risoluzione sinapsi 10-12. Heine, M., et al </em&gt; mostrato che la risoluzione spaziale di fast micro-ionoforesi può anche essere regolata per individuare dimensioni inferiori a 0.5 micron, che è più piccolo di dimensioni dei punti regolarmente conseguiti con uncaging due fotoni di glutammato 13. Con la veloce micro-ionoforesi è facilmente possibile utilizzare due o più pipette iontoforesi e metterli a diversi punti, anche lontani sull&#39;albero dendritico. In questo modo, l&#39;integrazione di eventi eccitatori, compresi quelli di differenti vie, può essere indagato. È anche possibile utilizzare un glutammato e GABA una pipetta riempita Iontoforetico contemporaneamente. In questo modo l&#39;effetto di inibizione GABAergica in luoghi diversi relativi all&#39;ingresso di eccitatorio (on-path, off-path inibizione) può essere studiato. Inoltre, l&#39;impatto della inibizione da interneuroni di targeting specifici domini neuronali, come dendriti distali, soma o assoni 14, può essere indagato mediante ionoforesi GABA. In neuroni in coltura, veloce micro-ionoforesi offre l&#39;opportunità di investigate distribuzione sinapsi singolo e gli aspetti elementari della comunicazione sinaptica in neuroni in modo molto più dettagliato 10,11. In questo articolo si dimostra in dettaglio come stabilire ionoforesi glutammato e GABA per l&#39;uso in fettine di cervello acuto, che permette di indagare l&#39;integrazione sinaptica degli input eccitatori e inibitori in dipendenza della posizione di ingresso, i punti di forza di input, e la tempistica, da soli o in interazione. Noi evidenziare i vantaggi ei limiti di questa tecnica e su come risolvere i problemi con successo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

Uno degli interessi fondamentali nel campo delle neuroscienze è quello di comprendere l&#39;integrazione di input eccitatori e inibitori lungo il molto complessa struttura dell&#39;albero dendritico, che finisce per produzione neuronale di potenziali d&#39;azione presso l&#39;assone. L&#39;influenza dei diversi parametri spaziali e temporali di specifica ingresso sinaptica neuronale in uscita è attualmente sotto inchiesta, ad esempio, la distanza di attenuazione in funzione degli ingressi dendritiche, l&#39;interazione dipendente dalla posizione degli ingressi spazialmente segregati, l&#39;influenza di inibizione GABAergig sull&#39;integrazione eccitatorio, lineare e le modalità di integrazione non lineari, e molti altri. Con rapido micro-ionoforesi di glutammato e GABA è possibile indagare con precisione la integrazione spaziale e temporale di eccitazione e di inibizione GABAergica glutammatergica. Requisiti tecnici critici sono o una lampada fluorescente triggered, diodi emettitori di luce (LED), o di un due fotoni SCAnning microscopio per visualizzare rami dendritici senza introdurre significative foto-danneggiamento del tessuto. Inoltre, è molto importante avere un amplificatore micro-ionoforesi che permette la rapida compensazione capacitanza di pipette ad alta resistenza. Un altro punto cruciale è che nessun trasmettitore è involontariamente rilasciato dalla pipetta durante l&#39;esperimento. Una volta stabilito, questa tecnica darà segnali affidabili e riproducibili con un alto neurotrasmettitore e la posizione specificità. Rispetto al glutammato e GABA uncaging, ionoforesi veloce permette utilizzando entrambi i trasmettitori contemporaneamente ma in luoghi molto distanti senza limitazione al campo di vista. Ci sono anche vantaggi rispetto alla focale stimolazione elettrica degli assoni: con micro-ionoforesi la posizione del sito di ingresso sicuramente noto ed è sicuro che solo il neurotrasmettitore di interesse viene rilasciato. Tuttavia è da considerare solo quest&#39;ultimo con il micro-ionoforesipostsynapse si attiva e aspetti presinaptico del rilascio di neurotrasmettitori non sono risolti. In questo articolo mostriamo come configurare micro-ionoforesi in esperimenti fetta del cervello.

Un approccio semplice per determinare la diffusione spaziale di ionoforesi è retrarre l&#39;pipetta Iontoforetico a gradini dalla dendrite, mantenendo costante la glutammato espulso. Abbiamo trovato che l&#39;estensione spaziale di una stimolazione micro-Iontoforetico aveva un diametro di circa 12 micron (Figura 1 mostra raggio). Quanto in profondità nel tessuto della ionoforesi può essere utilizzato dipende dalla rigidità della pipetta. Tuttavia, le pipette iontoforesi necessari per esperimenti in ...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l&#39;integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K Views.  University of Bonn. In questo articolo introduciamo veloce micro-ionoforesi di neurotrasmettitori come tecnica per studiare l'integrazione di segnali post-sinaptici con elevata precisione spaziale e temporale.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Ricerca

Neuroscienze

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: Implementazione di un simulatore di movimento Novel per Indagare l&#39;integrazione multisensoriale Percorso in tre dimensioni

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

L&#39;utilizzo di un α-bungarotossina Binding Tag sito per studiare GABA un recettore di membrana localizzazione e il traffico

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

L&#39;induzione di uno Stato Isoelectric cervello per studiare l&#39;impatto di endogeno Synaptic attività su NEURONALE<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un'analisi di flusso di calcio High-throughput per studiare i recettori NMDA con sensibilità al glutammato e glicina/D-serina

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...