Gli autori desiderano ringraziare A. Benham per l&#39;assistenza allo sviluppo del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concessione NS06747 al BAB

1. Preparazione di Worms per l&#39;imaging Questo segmento del protocollo si basa su Published C. tecniche di coltura elegans 1,2, e viene illustrato in Figura 1. <ol><li> Crescere vermi su alti peptoni piastre di agar NGM (10 cm) con teste di serie NA22 E. coli fino quasi morire di fame. Se immunostaining, una piastra in modo affidabile a sufficienza per produrre i vermi 1 macchia individuale, tenendo conto delle perdite lungo la strada, ei rigidi criteri utilizzati per selezionare i vermi per l&#39;imaging (vedi Parte 2). </li><li> Harvest di vermi versando alcuni ml di ddh 2 0 sulla piastra, agitando brevemente, e versando liquido in un tubo da 15 ml (ripetere se necessario per trasferire la maggior parte dei vermi al tubo). Pellet in centrifuga clinica per 3 min, g 1000x. Lavare pellet 1-3x con ddh 2 O fino surnatante è chiaro a rimuovere i batteri residui. Usare pipette in polipropilene per rimuovere surnatanti, come i vermi attaccano al vetro(Da questo punto in poi è fondamentale ridurre al minimo il tempo tra i passaggi per evitare perdite di efficienza uovo). </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere verme pellet in 5 ml di soluzione di ipoclorito alcalino per lisare vermi e uova di rilascio. Rock delicatamente, ed esaminare i tubi sotto un microscopio da dissezione circa una volta al minuto. Quando circa il 50% di vermi vengono lisati (appariranno piegato e rotto aperto), terminare la lisi compilando il tubo verso l&#39;alto con il tampone Egg, invertendo più volte, e cubettatura per 3 min, g 1000x. Tempo di lisi non deve superare i 5 minuti. </li><li> Rimuovere il surnatante con la pipetta di trasferimento, pellet e lavare 3 volte con il tampone di Egg. </li><li> Per separare le uova dai detriti, li galleggiano su un cuscino del 30% di saccarosio in DDH 2 O: dopo il lavaggio finale dal punto 1.4, rimuovere con cautela il surnatante e risospendere pellet in 5 ml ddh 2 0. Aggiungere 5 ml di saccarosio sterile al 60% in DDH 2 O, e mescolare bene. Spin in centrifuga clinica 6 min, g 1000x. Le uova si raccoglieranno nella parte menisco (saranno sciutaVE aspetto torbido), mentre detriti pellet. </li><li> Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, aspirare le uova in un volume minimo e trasferire alle piastre di agar non teste di serie NGM. Le uova aderiscono al lato del tubo può essere risciacquato con delicatezza e trasferite. Una piastra di 10 cm non teste di serie per ceppo analizzato è sufficiente. </li><li> Incubare le piastre non seminati con le uova durante la notte (~ 16 ore) a 20 ° C. Ventilare la piastra per le prime ore di asciugare lasciando il coperchio un po &#39;fuori per qualche ora, ma essere sicuri di coprire tutta la notte. </li><li> Dopo la schiusa, trasferire le larve L1 ad un tubo di 15 ml conica in S basale (aggiungere alcuni ml S basale alla piastra, turbine, versare nel tubo). Pellet in centrifuga clinica (3 min, 1000x g), risospendere in un volume minimo di Basal S, e il trasferimento di 10 cm NGM piastre di agar seminate con NA22 batteri. Utilizzare 2 piastre qui per ciascun piatto originale dal punto 1.1. Incubare fino al raggiungimento dell&#39;età worm desiderato. </li><li> Monitorare le culture una o due volte al giorno. Se sono in pericolo of fame, trasferimento a fresco NA22 piatti. Per la wild-type worm N2, la fame è preceduta dalla formazione di una linea o ondata di worm che si muove attraverso la piastra come animali migrano in massa lontano da alimenti impoverito zone. Una volta queste forme, il cibo sarà completamente esaurito in poche ore. </li><li> Worms sono ora pronti per immunostaining o immagini dal vivo. Fissaggio e colorazione vermi in sospensione è ottimale perché un gran numero di vermi intatti può essere ripreso con facilità. Procedure di colorazione in base al protocollo di Finney e Ruvkun 3-6 sono preferibili a congelare-rompere le procedure perché un gran numero di vermi sono necessari per l&#39;imaging. </li></ol> 2. Confocale Imaging <ol><li> Montare i vermi sulle diapositive per l&#39;imaging confocale. Regolare la densità di vermi a qualche centinaio per microlitro. Effettuare una pad di agarosio al 2% in S-basale circondato da un sottile anello di vaselina per impedire l&#39;evaporazione durante l&#39;imaging (applicato tramite una siringa 3 ml dotato di un cut-off 25 gauge). Pipettare unpochi microlitri della sospensione verme su un vetrino (uso anestetico se immagini vermi vivi), e abbassare il pad agarosio sul vetrino, diffondendo i vermi in modo uniforme sul pad. </li><li> Selezionare vermi per l&#39;imaging. Scegliere vermi dove le sinapsi di interesse sono orientate verso la lente obiettivo, con spostamento radiale di non più di ± 45 ° (dove 0 ° mezzo orientato direttamente verso l&#39;obiettivo). Eseguire questa valutazione rapida (pochi secondi) per evitare photobleaching. La scala delle colture iniziali è ottimizzato per garantire sufficienti worm in grado di soddisfare questi criteri geometrici. </li><li> Completare la confocale del campione. Campioni relativamente piatta che può essere compreso all&#39;interno di circa 14 micron di spessore 0,4 sezioni produrre i migliori risultati. Alta velocità, immagini a bassa risoluzione (512 x 512 pixel) sono sufficienti per una rapida raccolta accurata dei dati. Evitare di saturare il rivelatore con intensità di segnale eccessivi, ciò causerebbe sottostima della fluorescenzasegnali. </li></ol> 3. Identificazione automatica e analisi dei singoli cluster Synaptic <ol><li> Aprire file TIF multi-uscita dal microscopio confocale utilizzando Volocity 4.0 (o superiore) software (PerkinElmer). </li><li> Crop via le aree dell&#39;immagine che non contengono la struttura di interesse (Image -&gt; Focus estesa -&gt; Seleziona area di interesse utilizzando &#39;Freehand ROI&#39; Strumenti -&gt; Actions -&gt; Ritaglia alla selezione; Figura 2A). Nota, messa a fuoco estesa produce una z-piano di proiezione sullo schermo del computer per aiutare la vostra analisi, ma non influisce sui dati sottostanti, lo stesso vale per le regolazioni di luminosità e contrasto, se necessario). </li><li> Misurare la lunghezza della zona analizzata utilizzando lo strumento Linea. La lunghezza della linea sarà calcolato e aggiunto alla tabella di dati (Figura 2B). </li><li> Identificare gli oggetti utilizzando i &#39;oggetti per Intensity&#39; filtro (modalità Misure). Specificare una soglia in modo tale che i cluster sono sinapticheevidenziato e non-sinaptico sfondo non è (Figura 2C). Inclusione di un marcatore indipendente synaptic etichettato con un altro colore può aiutare a identificare in maniera univoca sinapsi. Sinapsi Tipiche variano da pochi a qualche centinaio di voxel. Impostare la soglia di una volta utilizzando un campione di controllo, e utilizzarlo per tutti i campioni successivi. Thresholding ogni campione separatamente è inaccettabile perché introduce la possibilità di bias sperimentatore. Gli oggetti vengono selezionati e tabulati automaticamente (Figura 2D). </li><li> Organizzare ed esportare i dati. Eliminare gli oggetti di 2 o meno voxel, poiché questi sono di solito granelli di sfondo. Questi possono essere eliminati per filtrazione ulteriori, o durante la successiva analisi. Per facilitare la loro valle di trasloco, riordinare i file di dati &#39;size oggetto&#39; in modo che si raggruppano tutti. Esportare i dati in formato CSV, che possono essere aperti da Microsoft Excel o altri fogli di calcolo. Ogni immagine produce un file di output. </li><li> Se Volocity morbidaware non è disponibile, i metodi alternativi per l&#39;analisi Z-plane proiezioni di dati confocale possono essere utilizzati (per esempio rif. 7, o l&#39;analisi manuale, con ImageJ), anche se a 3 dimensioni la perdita di informazioni (vedi Discussione). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Il metodo di quantificazione presentate dovrebbero essere in grado di distinguere tra le popolazioni di cluster di differente luminosità e volumi diversi. Immagini rappresentative e corrispondenti dati quantitativi presentati in Figura 3 mostrano esempi di differenziazione sulla base di questi parametri. Come regola generale, i risultati devono essere conformi a quanto è evidente a occhio. Nel caso di UNC-49 del recettore GABA immunocolorazione il cavo ventrale nervo di C. elegans, tutti gli animali in genere è apparso molto simile in dimensioni e grado, e il totale dei valori sinaptici fluorescenza per un gruppo di cinque vermi (normalizzata alla lunghezza del cordone nervoso analizzato) ha mostrato errore standard<html> valori di circa il 10% della media 4. Mutazione genetica e di altri trattamenti sperimentali (farmaco esposizione, ad esempio) possono alterare non solo il volume ed i valori di intensità e di distribuzioni di frequenza di cluster sinaptici, ma forse il tempo di sviluppo portate e la sincronia dei vermi, che porta ad una maggiore variabilità. Tuttavia, i risultati quantitativi deve sempre rispecchiare ciò che si può apprezzare visivamente e in caso contrario, l&#39;ispezione delle immagini e gli oggetti individuati dalla Volocity dovrebbe rivelare dove è verificato l&#39;errore e suggerire azioni correttive, come re-soglia o la rimozione di oggetti artefattuali. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig1.jpg" /> Figura 1. Preparazione di sincrona C. culture elegans. culture sincroni sono ottenuti da questa procedura perché C. arresti di sviluppo elegans e la fase larvale L1 in assenza di cibo, e riprende quando il cibo viene introdotto. <html> ove_content &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig2.jpg" /> Figura 2. La quantificazione del puncta sinaptica. <ol class="ualpha"><li> Regioni estranee dell&#39;immagine vengono tagliate per ridurre le dimensioni dei file e aumentare la specificità. Pannello a sinistra mostra l&#39;immagine di partenza, pannello centrale mostra regione selezionata, pannello di destra mostra l&#39;immagine dopo il ritaglio. Il rosso è il segnale UNC-49 immunofluorescenza del recettore GABA, il segnale verde è sinaptobrevina-GFP (un marcatore presinaptico), espresso in neuroni presinaptici GABA 4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2alarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . </li><li> Una linea è disegnata la lunghezza del segmento cordone nervoso da analizzare, e la sua lunghezza è automaticamente registrato nella tabella dei risultati. Questa informazione è necessaria per normalizzare i dati sinaptici a causa della lunghezza del cordone nervoso analizzabile, che può variare diverse volte, se i vermi diventano frammentati durante la colorazione.www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2blarge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. </li><li> Una soglia viene applicato per identificare singoli gruppi sinaptici. Pannello a sinistra mostra l&#39;immagine prima della soglia, esempi di diversi livelli di thresholding sono mostrati in pannelli separati (segnale verde omesso). Ogni oggetto identificato è raffigurato sull&#39;immagine come una regione colorata. Si noti la corrispondenza tra i cluster visivamente evidenti sinaptiche in più a sinistra del pannello e le regioni colorati sul più a destra del pannello. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2clarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . </li><li> Ogni oggetto è identificato elencati separatamente nella tabella dei risultati. Singoli oggetti possono essere selezionati e sono evidenziate sull&#39;immagine per l&#39;ispezione se lo si desidera. Si noti che la tabella contiene le informazioni per il rosso (&#39;rodamina&#39;) e verde (&#39;EGFP&#39;) canali, le informazioni del canale verde è potenzialmente fuorviante dato che gli oggetti eranoidentificato basata strettamente sul fluorescenza rossa. Questa analisi può essere eseguita anche su immagini a colori singoli. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4090/4090fig2dlarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4090/4090fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi. Micrografie rappresentative provenienti da wild-type C. elegans colorati per UNC 49 recettori GABA prima (A) e dopo (B) trattamento con muscimolo, un agonista del recettore GABA che provoca recettori per diventare downregulated dopo lunga esposizione. I pannelli mostrano immagini ritagliate prima (a sinistra) e dopo (a destra) della soglia e la rimozione di macchie di fondo di piccole dimensioni. (C) Terreni di parametri quantitativi sinaptici per i modelli di cui (A) e (B): fluorescenza normalizzata alla lunghezza totale del nervo cavo (a sinistra), e istogrammi probabilità cumulativa di singoli contenuti fluorescenza sinapsi (al centro) e il volume sinapsi (right), che evidenzia una riduzione statisticamente significativa del contenuto sinaptica e il volume indotta dall&#39;esposizione agonisti (n = 60 sinapsi per non trattate, n = 115 sinapsi per muscimolo trattati, P &lt;0,001, test di Kolmogorov-Smirnov <a href="http://www.physics.csbsju.edu/stats/KS-test.html" target="_blank">http://www.physics.csbsju .edu / stats / KS-test.html</a> ).

<ol>
	<li>Christensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33, 503-514 (2002).</li><li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+culture+methods.">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122, 2517-2527 (1996).</li><li>Davis, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+trafficking+as+a+mechanism+for+regulating+GABAA+receptor+abundance+at+synapses+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Rowland, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+terminals+independently+regulate+synaptic+clustering+and+autophagy+of+GABAA+receptors+in+Caenorhabditis+elegans.">Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).</li><li>Burbea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+and+AP180+regulate+the+abundance+of+GLR-1+glutamate+receptors+at+postsynaptic+elements+in+C.+elegans.">Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans.</a> Neuron. 35, 107-120 (2002).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+regulated+by+the+insulin-like+signaling+pathway+underlies+salt+chemotaxis+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).</li><li>Sankaranarayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).</li><li>McDonald, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+functional+characterization+of+fluorescent,+N-terminally+tagged+CB1+receptor+chimeras+for+live-cell+imaging.">Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging.</a> Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).</li><li>Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+neuropeptide+release+induced+by+octopamine+without+Ca2++entry+into+the+nerve+terminal.">Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo qui presentato è stato progettato per estrarre quantitativi multi-parametri dati per grandi popolazioni di sinapsi in C. elegans, massimizzando al contempo la coerenza all&#39;interno dei gruppi di trattamento. Tre caratteristiche contribuiscono a questi obiettivi. In primo luogo, immunostaining viene eseguita su popolazioni sincroni a vite senza fine di garantire che tutti gli animali sono la stessa età. Questo passaggio è fondamentale dato che il regolamento per lo sviluppo dei livelli di espress...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del software </td><td> Azienda </td><td></td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Volocity v4.0 o superiore </td><td> PerkinElmer / Improvision </td><td></td><td> Controlla il tuo impianto locale nucleo di imaging per l&#39;accesso a questo software. Il software demo è disponibile sul sito PerkinElmer. Questo metodo richiede solo il modulo La determinazione quantitativa di Volocity. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Egg tampone </td><td> NaCl KCl CaCl 2 MgCl 2 HEPES (Regolare il pH a 7.3) </td> &lt;td&gt; 118 mm 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM </td></tr><tr><td> Ipoclorito alcalino (per 5 ml) </td><td> Candeggina Fresh (scartare flacone 30 giorni dopo l&#39;apertura) 10 N NaOH ddh 2 O </td><td> 1,0 ml 0,25 ml 3,75 ml </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Solutions. </td></tr></tbody></table>

automated quantification of synaptic fluorescence in c. elegans

Forza Synapse si riferisce alla ampiezza delle risposte post-sinaptici a eventi presinaptici di rilascio dei neurotrasmettitori, e ha un impatto significativo sulla funzione complessiva del circuito neurale. Synapse forza dipende in modo critico l&#39;abbondanza di recettori neurotrasmettitori raggruppati in siti sinaptici sulla membrana postsinaptica. Livelli di recettori sono stabiliti evolutivamente, e può essere alterato da traffico tra i diversi centri del recettore di superficie localizzato, subsynaptic e intracellulare, che rappresentano importanti meccanismi di plasticità sinaptica e neuromodulazione. Metodi rigorosi per quantificare sinapticamente-localizzato abbondanza recettore del neurotrasmettitore sono essenziali per studiare lo sviluppo e la plasticità sinaptica. Microscopia a fluorescenza è un approccio ottimale perché conserva l&#39;informazione territoriale, distinguendo da synaptic non-sinaptici piscine e discriminando tra le popolazioni dei recettori localizzati a diversi tipi di sinapsi. Il modello genetico dell&#39;organismo Caenorhabditis elegans è particolarmente adatto per questi studi a causa della piccola dimensione e la relativa semplicità del suo sistema nervoso, la trasparenza, e la disponibilità di potenti tecniche genetiche, consentendo l&#39;esame di sinapsi nativi in animali intatti. Qui vi presentiamo un metodo per quantificare marcato in fluorescenza recettori dei neurotrasmettitori sinaptici in C. elegans. La sua caratteristica fondamentale è l&#39;identificazione automatica e l&#39;analisi delle singole sinapsi in tre dimensioni in multi-piano i file di output microscopio confocale, la posizione tabulazione, volume, intensità di fluorescenza e fluorescenza totale per ogni sinapsi. Questo approccio ha due vantaggi principali rispetto analisi manuale di Z-Plane proiezioni di dati confocale. In primo luogo, perché ogni piano del set di dati confocale è incluso, nessun dato viene perso attraverso z-piano di proiezione, in genere basato sulle medie intensità pixel o massimi. In secondo luogo, l&#39;identificazione delle sinapsi è automatizzato, ma può essere ispezionati da exsperimentatore, come procede l&#39;analisi dei dati, che consente l&#39;estrazione rapida e precisa di dati provenienti da un gran numero di sinapsi. Centinaia di migliaia di sinapsi per campione può essere facilmente ottenuto, producendo grandi quantità di dati per massimizzare la potenza statistica. Considerazioni per la preparazione di C. elegans per l&#39;analisi e l&#39;esecuzione confocale a minimizzare la variabilità tra gli animali all&#39;interno dei gruppi di trattamento vengono anche discussi. Nonostante sia stato sviluppato per analizzare C. recettori postsinaptici elegans, questo metodo è generalmente utile per qualsiasi tipo di sinapticamente-localizzata proteina, o addirittura, qualsiasi segnale di fluorescenza che è localizzato a cluster discreti, puncta o organelli. La procedura viene eseguita in tre fasi: 1) preparazione dei campioni, 2) confocale, e 3) analisi delle immagini. I passi 1 e 2 sono specifici per C. elegans, mentre il punto 3 è generalmente applicabile a qualsiasi segnale di fluorescenza puntata al microscopio confocale.

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Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

L&#39;abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi risoluzione<em&gt; C. elegans</em&gt;, Consentendo a centinaia di sinapsi di essere rapidamente caratterizzato all&#39;interno di un campione unico senza distorsioni introdotte dal z-piano di proiezione.

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

automated-quantification-of-synaptic-fluorescence-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

10.2K Views.  University of Toledo. L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi risoluzione C. elegans, Consentendo a centinaia di sinapsi di essere rapidamente caratterizzato all'interno di un campione unico senza distorsioni introdotte dal z-piano di proiezione.

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Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

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Neuroscienze

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogenesi

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

C. elegans Monitoraggio e valutazione del comportamento

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine sinaptiche in Culture Slice ippocampali

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Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante

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