Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento a RAW dal seguente: National Institutes of Health concede K01 DK083512, DP2 OD008470, e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Scholar concessione di una sovvenzione # 5-FY12-75; avviare i fondi presso l&#39;Università di Notre Dame College of Science e del Dipartimento di Scienze Biologiche; e un generoso dono per l&#39;Università di Notre Dame da Elizabeth e Michael Gallagher, a nome della famiglia Gallagher per promuovere la ricerca sulle cellule staminali. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta di dati e l&#39;analisi, decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il personale del Dipartimento di Scienze Biologiche per il loro sostegno, e il Centro per la Ricerca Zebrafish a Notre Dame per la loro straordinaria dedizione nella cura e il benessere della nostra colonia zebrafish. Infine, ringraziamo i membri del nostro laboratorio di ricerca per i loro commenti, discussioni e approfondimenti su questo lavoro.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, abbiamo descritto i metodi che consentono la visualizzazione dei componenti segmento nefrone in zebrafish adulto. L&#39;iniezione di destrano coniugati fluorescenti consente etichettatura PCT preferenziale a causa delle proprietà endocitiche di queste cellule del tubulo prossimale 30,38. Questo metodo può essere eseguito con grande flessibilità dovuta all&#39;esistenza di destrani che può essere ottenuta con uno stuolo di diversi coniugati fluorescenti. Inoltre, l&#39;uso di destrani lisina-fissabile è un modo particolarmente conveniente per etichettare PCT segmenti, in quanto non sono necessarie procedure di etichettatura secondari. Ciò consente il rilevamento del segnale relativamente semplice ed è compatibile con molte altre etichette fluorescenti, immunomarcatura, e l&#39;uso di linee transgeniche giornalista. Etichettatura fosfatasi alcalina segna anche il tubulo prossimale, con una forte reattività in PCT e leggermente più debole reattività nel PST. Infine, la colorazione DBA consente l&#39;etichettatura dei segmenti tubulari distali, che mostrano una characteristic ramificata morfologia. Diverse molecole lectine, che sono proteine ​​di zucchero vincolanti di origine non immune, sono stati ampiamente utilizzati per distinguere i segmenti del nefrone mammiferi 47. E &#39;interessante che DBA in zebrafish correla con segmenti dei tubuli distali, in quanto è utilizzato per contrassegnare dotti collettori dei reni in mammiferi 47. Presi insieme, questi metodi possono essere utilizzati in varie combinazioni per documentare la composizione e la funzione renale. Poiché tutti questi metodi possono essere utilizzati in preparazioni renali interi, forniscono strumenti per valutare la struttura e la funzione del nefrone tutto l&#39;organo, senza dipendere interamente da l&#39;uso di più in termini di tempo, i metodi noiosi, ad esempio, il lavoro cryosection e immunomarcatura. Tuttavia, le macchie descritti in questo articolo metodi sono vitali in cryosection. Analisi Cryosection genera campioni (rispetto a tutto mount) che sono più adatti per immunoistochimica per rilevare Pepti specificides, anche se naturalmente questo tipo di analisi richiede la disponibilità di anticorpi primari appropriati. Purtroppo una limitazione importante nel lavoro con il modello animale di zebrafish rimane la scarsa disponibilità di anticorpi. Così WISH rimane il più largamente usato, cioè, &#39;go-to,&#39; procedura per l&#39;analisi di espressione genica. WISH utilizzando reazioni substrato BCIP, NBT, e / o INT per produrre precipitati viola o rosse non è compatibile con colorazione fluorescente su criosezioni. Una possibilità sarebbe quella di invocare l&#39;uso della rilevazione WISH fluorescente, una procedura che è stata ottimizzata per i campioni embrionali di zebrafish e potrebbe essere adattato per l&#39;uso con il rene adulto. La descrizione dei metodi in questo articolo il video dovrebbe consentire un&#39;ulteriore sperimentazione di tecniche come WISH fluorescente in combinazione con linee di zebrafish transgenici in cui i singoli segmenti vengono etichettati con un giornalista, come eGFP o mCherry. In alternativa, i metodi descritti qui could essere testato in combinazione con altri coloranti vitali, ad esempio, altre lectine. Così, ulteriore adattamento ed espansione dei metodi qui descritti potrebbero essere invocate per soddisfare le esigenze del ricercatore per interi preparati renali montaggio e analisi. Come tali, questi metodi hanno un potenziale ampio per l&#39;attuazione con il modello di zebrafish per gli studi di rigenerazione in corso e anche in modelli di malattia genetica. Vi è un urgente bisogno di ricerca innovativa e trattamenti per afflizioni renali. Milioni di persone soffrono di qualche forma di malattia renale ogni anno che deriva da cause congenite, acute e / o croniche. Inoltre, la prevalenza della malattia renale continua a crescere in tutto il mondo, rendendo queste malattie un problema di salute pubblica globale 14,15. Trattamenti come l&#39;emodialisi sono disponibili in base al quale una macchina di dialisi esterno serve per liberare il sangue di scorie metaboliche del paziente se i loro reni non sono in grado di svolgere questo ruolo. Sfortunatamente, Questo intervento ha dei limiti, come trattamento in corso è necessario per la sopravvivenza. Inoltre, i pazienti richiederebbero un trapianto di rene, che può richiedere anni per ricevere una volta che un paziente è posto su una lista d&#39;attesa. Anche dopo l&#39;ottenimento di un trapianto di rene, molti pazienti soffrono gli effetti negativi a seguito della procedura e devono combattere questi effetti per il resto della loro vita. Queste difficoltà dimostrano la grave necessità per lo sviluppo di nuovi trattamenti per aiutare a prevenire o malattie renali o forse per aumentare la rigenerazione dei tessuti 8,16,52,53. Date le ovvie limitazioni etiche dell&#39;uso di cavie umane nei laboratori biomedici, modelli animali sono essenziali per lo studio della patogenesi delle malattie umane e per la sperimentazione di nuovi trattamenti. Come risultato della sua somiglianza anatomica e la vicinanza evolutiva, il topo è diventato il modello più diffuso delle malattie umane 45. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni con questo animale, inclusa,ing incapacità di visualizzare lo sviluppo degli organi in vivo e la praticità di completare schermi genetici su larga scala. Zebrafish sono una rilevante e utile organismo modello per lo studio dello sviluppo degli organi e modellazione delle malattie umane 45,46. Per quanto riguarda la malattia umana, esistono omologhi funzionali in zebrafish per quasi il 70% di tutti i geni umani 54,55. Studi recenti hanno messo in evidenza l&#39;utilità di zebrafish per molti settori della ricerca 31,37,56 rene. Studi di rigenerazione e riparazione in zebrafish dopo AKI suggeriscono che la rigenerazione tubulo epiteliale e neonephrogenesis sono due processi che si verificano e si sovrappongono durante la rigenerazione timecourse 30,37. L&#39;uso di un aminoglicoside antibiotico chiamato gentamicina è stata utilizzata come un paradigma lesione attraverso cui studiare i risultati di AKI in zebrafish adulto 29,30,37. Su una di circa due settimane periodo successivo lesioni da gentamicina, la Tubul prossimalees rigenerano, e nel frattempo nuovi nefroni formano tutto l&#39;organo 29,30,37. In generale, i meccanismi che regolano la rigenerazione epiteliale rimangono molto controversa. In quello proposto meccanismo del processo di riparazione, vi è l&#39;evento lesione acuta iniziale seguita da una desquamazione delle cellule morte nel lume. Avanti, c&#39;è una serie di de-differenziazione, proliferazione, e gli eventi di migrazione, dopo che le nuove cellule si differenziano, ripopolare la membrana basale feriti e funzione di ripristino al sito danneggiato. In alternativa, altri studi hanno suggerito che le cellule di ricambio derivano da cellule staminali / progenitrici che risiedono all&#39;interno tubuli del nefrone. Per quanto riguarda il processo di neonephrogenesis in zebrafish, aggregati cellulari sono stati osservati seguente AKI per iniezione gentamicina 29,30. Questi aggregati successivamente maturano in nuovi nefroni che Plumb in tubuli già esistenti 29,30. Il filo comune che unisce la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis è il loro fattore mistero puro e semplice: al momento non vi sono esponenzialmente più domande su come queste gesta di rigenerazione in quanto ci sono approfondimenti disponibili. Ad oggi, tuttavia, diverse linee emozionanti prove supportano l&#39;idea che la ricerca di rigenerazione renale utilizzando zebrafish può infatti fornire importanti spunti comparativi in AKI umana che può anche avere diretto traslazionale potenziale 56-58. Lo screening chimico per identificare piccole molecole che aumentano la proliferazione delle cellule progenitrici renali nell&#39;embrione zebrafish recentemente portato all&#39;identificazione della -butanoate inibitore delle istone deacetilasi metil-4-(feniltio) (m4PTB) 56,57. La somministrazione di questo composto di larve di zebrafish con gentamicina indotta AKI ha rivelato che la sopravvivenza larvale aumentato e che la proliferazione renale tubulare è stata rafforzata 56,58. Quando i topi con moderata AKI ischemia-indotta sono stati trattati con m4PTB, il loro recupero è stato accelerato in association con una riduzione sia in tubolare di atrofia e arresto del ciclo cellulare delle cellule proliferanti tubulari renali 58. Questi risultati suggeriscono che le vie responsabili per il normale sviluppo zebrafish renale e / o la risposta rigenerativa di AKI saranno conservati con i mammiferi 56. Così, mentre sono necessari ulteriori studi per prendere in giro a parte i meccanismi di rigenerazione, cioè quello di individuare le vie di segnalazione che sono coinvolti e comprendere la loro interazione, il pesce zebra fornisce una strada promettente per perseguire questo importante obiettivo nel campo nefrologia. Strumenti come le etichette cellulari nefrone descritte in questo protocollo rappresenta un gruppo di saggi che possono essere utilizzati per valutare la composizione e la funzionalità renale in modelli di AKI. Inoltre, possono essere applicati per caratterizzare modelli transgenici di malattia renale e possono fornire modi per identificare terapie chimiche in grado di promuovere il ripristino della struttura del nefrone dopo la diga renaleetà.

Il rene è un organo complesso che svolge una moltitudine di funzioni fisiologiche del corpo. La funzione più importante del rene è metabolica escrezione dei rifiuti, e questo compito è strettamente intrecciata con il mantenimento dell&#39;omeostasi fluido. Il rene svolge questi posti di lavoro filtrando il sangue e la formazione di urine, mentre in concomitanza regolazione della pressione sanguigna, livelli di elettroliti e dell&#39;equilibrio acido-base. Tubuli altamente specializzati epiteliali chiamate nefroni servono come unità funzionale di base del rene 1,2. Nei vertebrati adulti, nefroni sono in genere organizzati in una disposizione strettamente avvolto intorno un sistema di drenaggio centralizzato, permettendo così per molti tubuli per il confezionamento in abbastanza piccolo organo. Ad esempio, ogni rene umano può contenere oltre 1 milione di nefroni 3. Altri mammiferi come il mouse possiedono su ordine di 8-10.000 nefroni al rene 4. Il grado di complessità renale differisce tra questi mammiferi e altri vertebrates dovute a variazioni nel numero totale nefrone e la loro disposizione architettonica all&#39;interno del rene. Specie di vertebrati formano ben tre strutture renali successivi durante lo sviluppo, ed ogni forma display crescente complessità per quanto riguarda nefrone dotazione e disposizione: le pronephros, mesonefro, e metanefro. L&#39;ultima struttura renale da conservare serve come il rene adulto organo-tipicamente un mesonefro o un metanefro 2. Ogni forma di rene, tuttavia, ha una composizione basata nefrone-2. Il nefrone è il cavallo di battaglia del rene ed è responsabile per la filtrazione del sangue insieme con la secrezione metabolita e riassorbimento. Nefroni sono semplici strutture tubolari composti da cellule epiteliali e hanno una organizzazione segmentale, in cui discreti, domini altamente specializzati di epiteli differenziati eseguire compiti specifici. In ordine di flusso filtrato attraverso il nefrone, ci sono in genere tre parti principali che comprise ogni unità: (1) il corpuscolo renale, (2) un tubulo prossimale con, intermedio, e segmenti distali, e (3) un condotto di raccolta 1. Il tubulo prossimale è responsabile del riassorbimento di soluti organici, più in particolare glucosio e aminoacidi 1. Il tubulo intermedio (o di Henle) è un importante sito di sale e acqua regolazione 1. Infine, la messa a punto di sale e di altri ioni avviene nel tubulo distale e dotto collettore ed è altamente regolato dal sistema endocrino 1. Da lì, il filtrato viaggia attraverso l&#39;uretere e vescica, in definitiva uscita dal corpo come prodotto di scarto 1. La perdita di funzione renale può derivare da una moltitudine di cause che impediscono la normale attività nefrone. Queste cause possono verificarsi durante lo sviluppo del rene, ad esempio, i difetti congeniti che portano alla malformazione di nefroni 5, o cause di diversi tipi di danni (derivanti sia da genetica e environmeorigini ntale). Lesioni acquisite sono ampiamente classificati come lesione acuta del rene (AKI) o danno renale cronica (CKD). AKI comporta una perdita improvvisa della funzione renale, spesso derivanti da ischemia o tossina esposizione 6,7. Nei mammiferi, la riparazione epiteliale nefrone è possibile dopo tali lesioni 8, e molte persone presentano pieno ripristino della funzione renale dopo AKI. Tuttavia, AKI è anche associata ad alta morbilità e mortalità che sono stati riportati in un ampio 30 - 70% Intervallo di incidenza 6,7. CKD, al contrario, è associata con perdita progressiva della funzione renale che deriva da anni di danni prolungato, tipicamente associata a fibrosi 8,9. Inoltre, esiste un&#39;interazione tra AKI e CKD, sia come si può predisporre un individuo all&#39;altro 10-12. Per esempio, coloro che hanno sofferto di AKI sono più suscettibili di CKD e anche la morte 13. L&#39;incidenza della malattia renale, sia negli Stati Uniti e nel mondo, ha raggiunto epideproporzioni microfono e si prevede un aumento come la popolazione di età compresa tra espande, quindi non vi è una crescente necessità di individuare interventi di medicina rigenerativa per il rene 14,15. Nonostante la consapevolezza che i pazienti AKI possono recuperare, è stato a lungo pensato che il rene è un organo senza innati poteri rigenerativi. Questo punto di vista tradizionale è stato notevolmente modificato negli ultimi anni 16. Gli studi che indagano danno renale nei topi e nei ratti dopo AKI hanno dimostrato che le cellule epiteliali del tubulo del nefrone possono proliferare e ricostruire nefroni funzionali 17-20. Anche se i mammiferi possiedono questa capacità di adattamento di rigenerare nefroni, ci sono notevoli limitazioni e le risposte disadattivi possono essere innescate che portano alla fibrosi renale e CKD 21. Ad esempio, un recente studio ha dimostrato che la ripetuta ablazione delle cellule epiteliali in nefroni murini è stato associato con rigenerazione diminuita e nefroni fibrosi renale suggerendo-HAVEA limitata soglia di rigenerazione 22. Non ci sono prove che l&#39;adulto rene mammiferi forma nuovi nefroni per sostituire quelli persi o danneggiati, così la loro distruzione porta ad un deficit permanente nefrone 8,9. È interessante notare che alcuni vertebrati rispondono a AKI rigenerando nefrone epiteli e producendo anche nuovi nefroni, un processo denominato neonephrogenesis o nefrone neogenesi 23. Neonephrogenesis avviene nei pesci dopo l&#39;esposizione ad una tossina o resezione parziale, e modelli di pregiudizio hanno storicamente incluso il pesce rosso 24,25, tilapia 26, pattino 27, Medaka 28, e, più recentemente, il pesce zebra 29,30. Di questi, zebrafish fornire un modello di ricerca genetica praticabile per scoprire le vie cellulari e molecolari responsabili della rigenerazione renale. In questo articolo il video, dimostriamo come etichettare i segmenti del nefrone in zebrafish adulto. Conoscenze di anatomia nefrone, caratteristiche molecolari,e caratteristiche funzionali sono essenziali per gli studi renali futuro di successo utilizzando zebrafish. Il rene zebrafish adulto è una struttura mesonefro ed è intrinsecamente meno complessa in termini di numero nefrone e di organizzazione che la struttura metanefro trovati in mammiferi adulti, avians, e rettili 31. Tuttavia, zebrafish organizzazione segmento nefrone è analogo ai mammiferi, ed è stata la prima volta nel rene embrionale sulla base di studi di espressione genica 31-35. Nefroni zebrafish contengono segmenti lineari tubulari che includono il tubulo contorto prossimale (PCT), tubulo prossimale dritto (PST), distale precoce (DE), e distale tardi (DL) 31-35 (Figura 1). Nefroni Zebrafish adulti in possesso di segmenti tubolari simili 30,31,36,37 (Figura 1). La PCT può essere identificato anche da un fenotipo funzionale: le cellule epiteliali del PCT incorporeranno composti destrano fluorescente (10-70 kDa dimensioni) presenti nelcircolazione, che è stato utilizzato sia nella zebrafish rene embrionale ed adulto per valutare l&#39;assorbimento endocitica da queste cellule del tubulo prossimale 38-41 (Figura 1). Una differenza nel nefrone tra zebrafish e mammiferi è che zebrafish mancano di un tubulo intermedio, o di Henle 30-37; dal momento che questo funzioni segmento nei mammiferi per conservare l&#39;acqua, e zebrafish sono una specie di acqua dolce, senza l&#39;urgenza di concentrare l&#39;urina, non è sorprendente che zebrafish manca questo segmento 32,33. Pertanto, la composizione complessiva nefrone è in gran parte conservata tra il pesce zebra e reni mammiferi 32,33. Queste somiglianze hanno permesso zebrafish ad essere uno strumento di ricerca efficace per studiare le funzioni dei geni-renale espressa nel corso nefrogenesi sviluppo 32-35,42 e modellare numerose malattie renali 43,44, aggiungendo così alla lista sostanziale di condizioni umane che possono essere indagato utilizzandozebrafish 45,46. Oggi, il rene zebrafish adulto è un modello attraente per gli studi comparativi di rigenerazione renale a causa della sua trattabilità genetica e il palato espansione delle risorse tecnologiche disponibili per interrogare la funzione del gene e vie di segnalazione in questa specie. Diversi studi hanno utilizzato i mesonefro zebrafish per studiare i meccanismi di rigenerazione dopo AKI 29,30,37. Per la continua ricerca AKI utilizzando il rene zebrafish adulto, è essenziale disporre di metodi squisiti per etichettare diverse regioni e metodi nefrone per esaminare la funzionalità nefrone. Diversi metodi di analisi rene adulto sono stati adattati dai protocolli renali embrionali. Iniezione intraperitoneale di destrano fluorescente etichettati in zebrafish adulto etichette l&#39;epitelio PCT in mesonefro nefroni via endocitosi 30, come in embrioni di zebrafish 38-41 (Figura 1). Questo metodo è stato utilizzato per visualize quando tubuli prossimali riacquistano le loro proprietà riassorbire seguente AKI, che consente una valutazione della funzione fisiologica restaurato 30 (Figura 1). Un&#39;altra caratteristica del nefrone tubulo prossimale è che le cellule epiteliali in questo segmento in possesso di un bordo spazzola 37 che mostra alti livelli di fosfatasi alcalina endogena. Così, l&#39;epitelio prossimale può essere localizzato visivamente nel rene adulto zebrafish utilizzando una tecnica a fluorescenza conosciuta come Elf (marcato con enzima Fluorescence) -97 47. Qui, descriviamo come eseguire fluorescenti test di assorbimento di destrano 30,48 nell&#39;adulto rene zebrafish, in modo da ottenere una valutazione funzionale del tubulo prossimale e mappare le dimensioni e contorni di questo segmento tubulo. Avanti, descriviamo le tecniche di etichettare le regioni del tubulo prossimale del nefrone adulto con la fosfatasi alcalina etichetta fluorescente. In terzo luogo, si mostra per la prima volta che la rhodammina tag lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA), che è stato utilizzato come marcatore generale dei collettori nel rene dei mammiferi 49, segna i tubuli distali del rene adulto zebrafish. Come DBA è mutuamente esclusivo di fosfatasi alcalina colorazione, queste etichette forniscono un modo per distinguere ampiamente pan-prossimale rispetto tratti pan-distali del nefrone zebrafish adulto. Durante l&#39;attuazione di tali macchie fluorescenti sia in tutto il monte e sezioni istologiche al criostato, mettiamo in relazione queste etichette con i domini di espressione di geni soluto trasportatore che identificano in modo univoco ciascun segmento nefrone. Quindi questo protocollo contiene anche una guida per le procedure di trattamento dei tessuti modificati per tessuti adulti montare tutto ibridazione in situ (WISH) analisi sulla base della nostra embrione protocollo WISH 50. Tali procedure possono essere utilizzate in varie combinazioni (Figura 2) per documentare caratteristiche morfologiche e funzionali of adulti nefroni renali zebrafish. Così, questi protocolli possono essere applicati a studi di rigenerazione, la caratterizzazione fenotipica di altri modelli di malattia renale, e anche usati per studiare la formazione del rene adulto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Il modello di zebrafish è emerso come un sistema rilevante per studiare lo sviluppo del rene, la rigenerazione e la malattia. Entrambi i reni zebrafish embrionali e adulte sono composti da unità funzionali noti come nefroni, che sono altamente conservati con altri vertebrati, compresi i mammiferi. La ricerca in zebrafish ha recentemente dimostrato che due fenomeni distinti trasparire dopo nefroni adulti subiscono danni: in primo luogo, vi è la rigenerazione robusto all&#39;interno di nefroni esistenti che sostituisce le cellule epiteliali del tubulo distrutte; secondo, completamente nuovi nefroni sono prodotte da progenitori renali in un processo noto come neonephrogenesis. Al contrario, gli esseri umani e altri mammiferi sembrano avere solo una limitata capacità di rigenerazione epiteliale nefrone. Ad oggi, i meccanismi responsabili di questi fenomeni di rigenerazione del rene rimangono poco conosciute. Dal momento che i reni zebrafish adulti subiscono sia la rigenerazione epiteliale nefrone e neonephrogenesis, forniscono un eccezionale para sperimentaleparadigma per studiare questi eventi. Inoltre, vi è una vasta gamma di strumenti genetici e farmacologici disponibili nel modello zebrafish che possono essere utilizzati per delineare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano la rigenerazione renale. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive un insieme di tecniche di etichettatura che possono essere utilizzati per misurare la composizione e la funzionalità renale prova nefrone nel rene zebrafish adulto. Così, questi metodi sono ampiamente applicabili per il futuro caratterizzazione fenotipica di Zebrafish adulti paradigmi danno renale, che comprendono, ma non sono limitati a, i regimi di esposizione nephrotoxicant o metodi genetici di morte delle cellule bersaglio, quali il nitroreduttasi mediata tecnica di ablazione delle cellule. Inoltre, questi metodi potrebbero essere utilizzati per studiare perturbazioni genetiche in formazione rene adulto e potrebbero essere applicate anche per valutare lo stato renale durante la modellazione delle malattie croniche.

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.9K Views.  University of Notre Dame.  Il rene adulto zebrafish è un sistema eccellente per gli studi di rigenerazione e malattie renali. Un aspetto essenziale di tale ricerca è la valutazione della struttura e funzione del nefrone. Questo protocollo descrive le diverse metodologie che possono essere implementate per valutare la composizione nefrone tubulo e per valutare il riassorbimento renale. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Il prelievo di sangue per l&#39;analisi biochimica in Zebrafish Adult

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

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