Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Gli autori ringraziano il team tecnico e OEM a Gilson, INC per il supporto tecnico esteso.

Gli autori MKC, MJG, EEB, NJD e RO sono o erano al tempo dei dipendenti per lo sviluppo di InvivoSciences, INC che ha concepito e sviluppato dei protocolli robotici qui descritti. TW è il CSO per InvivoSciences INC. SH è un dipendente di Gilson INC.

Nel presente studio abbiamo sviluppato un metodo di coltura per la produzione robotizzata IPSC che miniaturizza e automatizza l&#39;alimentazione e il passaggio in un formato a 96 pozzetti mentre anche consentendo efficiente scale-up. Un robot liquido gestione è stato utilizzato per alimentare regolarmente le colonie IPSC e li passo a intervalli regolari da dissociazione enzimatica. Il robot è stato anche programmato per produrre lastre rivestite gel matrice extracellulare ed eseguire un gradiente di densità di semina. Quando fibroblasti e adiposo derivato iPSCs sono stati coltivati ​​in questo sistema per più di 20 passaggi, circa 3 mesi, pluripotenza è stata mantenuta, così come lo erano cariotipo stabili. Entrambe le linee di cellule erano in grado di differenziazione in cardiomiociti. Insieme, la collezione di protocolli qui descritta consente agli utenti con poca esperienza sulle cellule staminali cultura o accesso limitato alle attrezzature cultura specialistica, alle cellule staminali di coltura e di raggiungere una produzione di cellule o la manipolazione con il lavoro minimo e il costo su più righe. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; I protocolli robotici qui descritti forniscono un metodo per scale-up economico di produzione e nel trattamento IPSC. Un vantaggio è la cultura di cellule staminali e scalabile in un formato basato su piastra stabilito dimostrato qui e in precedenza 44,47 - 49 per mantenere la pluripotenza. Mentre gli altri formati di cellule pluripotenti scalabile di cellule staminali cultura rendimento 20,23,29 metodo basato questo piatto richiede essenzialmente nessun cambiamento nella disposizione della cultura, come adattamento alla sospensione, l&#39;uso di sostanze chimiche o antischiuma uso prolungato di Rho-chinasi inibitori 20. Questo metodo della piastra base può quindi rapidamente, e prevedibilmente, accogliere nuove linee in quanto le condizioni di coltura sono simili. Come l&#39;uso di iPSCs per la modellazione della malattia aumenta 4,6,19,50, nuove linee IPSC sono continuamente generate. Le tecniche qui descritte sono più adatti alla cultura nuova linee in medio-alto volume e la velocità perché la barriera di transizione sul formato è low. Questo è vero per la manodopera e apparecchiature necessarie per mantenere le colonie anche. Infine, perché il formato e la manipolazione sono simili per l&#39;ambiente utilizzata per ricavare e validare linee IPSC, le prestazioni della cultura, come la differenziazione diretta, è probabile che sia più prevedibile. La figura 8 illustra una strategia per scale up della produzione di cellule staminali in piastre da 96 pozzetti. Una piastra (Ciclo 0) è utilizzata per seminare robot 12 nuovi piatti, un aumento di 12 volte (Ciclo 0 a 1). Dopo diversi giorni di alimentazione, uno dei dodici piastre è diversi passaggi per seminare un&#39;altra serie di dodici piastre (ciclo 1 al ciclo 2). I rimanenti piastre undici sono ora disponibili per altri usi e rappresentano la componente produzione del sistema. A questo ritmo, il passaggio di una piastra fornirà 11 piatti ogni ciclo, o ogni 3-4 giorni. Questa metodologia può essere scalata maggiore quando più piastre sono diversi passaggi, come illustrato nel passaggio dal Ciclo 2 Ciclo 3. In Ciclo 3, due piastre sonosempre utilizzato per mantenere la colonia e delle sementi 24 nuovi piatti. I restanti 22 piastre sono quindi disponibili per l&#39;uso dopo ogni ciclo di passaggio. In qualsiasi punto del ciclo di manutenzione l&#39;utente può seminare più piastre per aumentare la produzione. Un esempio potrebbe essere quello di passaggio ogni colonna per due cicli di crescita. Il primo passaggio converte una piastra in dodici piastre, e ciascuno dei dodici piastre viene utilizzata per seminare 144 piastre. In questo caso, un utente inizia con una piastra e dopo due passaggi, o circa 1,5-2 settimane di coltura, di 144 piastre. Ad esempio, i fibroblasti e adipose linee IPSC producono circa 25-75.000.000 cellule per piastra a 96 pozzetti quando si è pronti per il passaggio. 144 piastre potrebbero quindi rappresentare circa 4-7 x 10 9 cellule. Qual è il peso del lavoro per la realizzazione di 144 piastre da 96 pozzetti robot? Uno degli obiettivi di questo lavoro è stata la produzione scalabile di cellule staminali che ha ridotto il lavoro rispetto ai tradizionali (targa ad esempio, 6 pozzetti) staminali coltura cellulare. Il robot accomplishes questo per alleviare la necessità di gestire fisicamente ogni piatto durante l&#39;alimentazione e passaging. Mentre a 96 pozzetti scale di produzione piatto linearmente come sarebbe in 6 pozzetti tradizionali, il tempo di un tecnico passa a lavorare con i piatti è molto meno con la cultura robotica. L&#39;efficienza di produzione della cultura robotica deriva da questa differenza (Figura 9). E &#39;stato trovato i tecnici hanno potuto rimuovere un 6-pozzetti dal termostato, controllare sul microscopio, poi aspirare e alimentare il piatto in circa 3,5 minuti. In confronto, i tecnici spendono circa 30 sec rimuovendo una piastra a 96 pozzetti da incubatore e ispezionandolo sul microscopio per la densità e la contaminazione prima dell&#39;immissione sul robot. Con un protocollo alimentazione espanso simile a quella sopra descritta, sei piastre a 96 pozzetti possono essere caricati e alimentati, che dura circa 21 min, o 3,5 min per piastra. Il tempo trascorso totale per alimentare un piatto è comparabile tra robotè richiesto ic e metodi manuali, ma per alimentazione mano 6 piatti di un tecnico per tutti i 21 minuti, mentre il tecnico spende gestire i sei piatti per il robot (un controllo 30 sec per piastra) a soli 3 minuti. Come mostra la figura 9 mostra, il tempo trascorre un tecnico movimentazione 144 piastre utilizzando il robot è di circa 1,2 ore, rispetto all&#39;8 hr manualmente il robot farà mai gestire un errore piastre o il trasferimento di liquidi. Le 96 pozzetti IPSC metodi di coltura qui descritti forniscono una piattaforma per le attività di screening trattabili complesse. Poiché ogni bene è geneticamente identici e testa di serie alla stessa densità dallo stesso pool iniziale, le variabili possono essere distribuiti in tutta la piastra e mantenuti dal robot con serbatoi disponibili in commercio per separare condizioni. Questo sarebbe utile per esperimenti come la crescita delle cellule staminali dei media sviluppo 34,35,47, substrato o condizione cultura test e studi di tossicità che utilizzano cellule staminali51. Dal momento che ogni linea di cellule staminali è unica in termini di requisiti ottimali dimensioni delle colonie e di passaggio, si può usare questo sistema per modulare la densità di semina, la frequenza di alimentazione e la manipolazione passaggio manipolando le colonne raccolte, l&#39;agitazione meccanica durante il passaggio e la frequenza di alimentazione. Iterazione attraverso queste variabili permette all&#39;utente di trovare rapidamente una serie di condizioni idonee per la cultura di una nuova linea o sviluppare nuove tecniche di coltura. Il sistema robotico è anche in grado di mantenere 96 colonie di cellule staminali parallele ma indipendenti. Quando IPSC sono derivati ​​da cellule somatiche o clonato dopo la manipolazione genetica, molti cloni paralleli sono proiettati per produrre potenziali linee IPSC. Una volta che le singole cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti, il sistema può alimentare e di passaggio le piastre a 96 pozzetti mantenendo ogni colonia segregata. Ciò consente molto elevato throughput quando si seleziona potenziali cloni ed elimina la difficoltà di coltura fisicamente 96 linee parallele. Questo metodo inoltrellows scalati produzione di ogni clone in modo che il materiale è facilmente disponibile per l&#39;analisi in parallelo. Infine, prevediamo integrando tali tecniche di coltura con un sistema di traffico piatto robotico che trasporta piastre da e per l&#39;incubatore abilitazione coltura completamente automatizzato. Ciò potrebbe essere realizzato con più robotica complessi che consentono una maggiore espansione poiché i protocolli di base qui descritte sono trasferibili ad altri sistemi basati piastra. I primi passi fondamentali per affrontare nei protocolli sono quelli che impediscono e controllano per la contaminazione, come passi 1.5 e 4.2. Contaminazione, come discusso in precedenza, può essere evitato con successo se buona tecnica sterile e il buon senso sono utilizzati. E &#39;indispensabile, indipendentemente dal formato coltura di cellule staminali, che il controllo dell&#39;operatore di contaminazione e di farlo in questo protocollo i passi indicati ridurrà notevolmente il rischio di contaminazione. La corretta applicazione del gel matrice extracellulare è un secondo esspasso ziale per il successo globale di questo protocollo. Senza rivestimento adeguatamente le piastre a 96 pozzetti, le cellule staminali non crescerà. Un problema comune è il rivestimento ben incompleta. L&#39;esperienza ha dimostrato che le bolle d&#39;aria, attrazione elettrostatica e capillarità ostacolano rivestimento ben completa. La fase di pre-bagnatura (1.6) è stato sviluppato per migliorare significativamente il rivestimento ben inferiore e non deve essere ignorato. Questa fase di pre-bagnatura sembra ridurre l&#39;apparente idrofobicità della piastra a 96 pozzetti di plastica in modo che quando il rivestimento in gel matrice extracellulare viene applicato è uniformemente distribuito attraverso il ben inferiore e lati. Si raccomanda inoltre di toccare delicatamente le piastre a 96 pozzetti contro una mano pulita una volta rivestito per assicurare una distribuzione soluzione di gel matrice extracellulare anche. I parametri di dissociazione sono importanti anche per ottimizzare. Incubazione estesa con l&#39;enzima o il reagente di dissociazione base EDTA si tradurrà in singole cellule che possono o non possono essere l&#39;obiettivo durante il passaggio. Pertanto, l&#39;operatoredovrebbe prestare particolare attenzione a come il tempo di dissociazione, forza triturazione, e le ripetizioni di lavaggio influenzano la morfologia delle colonie e la salute e regolare di conseguenza. Comprendere i limiti alle tecniche qui descritte sono di fondamentale importanza per il funzionamento di successo. Come in qualsiasi altra impostazione coltura cellulare, l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti presenta un rischio relativamente alto di contaminazione. Come sopra descritto, un tecnico è gestire ogni piastra durante l&#39;alimentazione e passaging; per esempio, quando si apre il coperchio, mettere la piastra sulla base del robot, e controllando la piastra sul microscopio. Quindi, come indicato dopo passo 1.5, è imperativo non toccare la parte interna del coperchio qualsiasi piatto o esporre questa parte a qualsiasi superficie potenzialmente contaminati, come i blocchi riscaldanti inclinate o perni verticali sul letto. Durante lo sviluppo del protocollo questa limitazione è stato scoperto e ha dato l&#39;impulso per sviluppare un rack per contenere coperchi piastra per mantenere la sterilità. Allo stesso modo, i serbatoi di valle, puntali e other forniture sul liquido letto manipolazione robot sono potenziali fonti di contaminazione, perché sono aperti per l&#39;ambiente e la manipolazione da parte del tecnico. Pertanto, buona tecnica sterile deve essere applicato come la riduzione dei movimenti rispetto ai materiali della cultura esposti o liquidi aperti. Un altro limite è che quando il protocollo è calcificato, controllando visivamente ogni ben di&gt; 100 piastre a 96 pozzetti è ingombrante. Questo può essere affrontato da ispezionare visivamente tutta la piastra per i segni di contaminazione, come i media torbido, per identificare i pozzi sospetti. Per future scala up, verrà incorporata uso di un microscopio automatico e indicatore della crescita cellulare e la potenziale contaminazione. In sintesi, l&#39;high-throughput da 96 pozzetti piattaforma basata descritto qui offre un metodo fedeltà riproducibili, alto per la cultura e la produzione di cellule staminali in un formato piatto. Questo metodo riduce l&#39;esperienza richiesta, delle attrezzature necessarie e di lavoro dedicata per arginare coltura cellulare mentremantenendo i vantaggi di cultura tradizionale aderente.

L&#39;uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) è aumentato in modo significativo dal loro derivazione nel 2007 1 per il test composto, medicina rigenerativa e modellazione malattia 2-6. Questa richiesta viene dalla capacità di IPSC per produrre un gran numero di cellule pluripotenti che possono essere differenziate in cellule somatiche in una quantità senza precedenti. Poiché le tecniche di differenziazione dirette migliorano 7-10 e lo sviluppo di cellule umane o di modellazione dei tessuti e terapia cellulare aumenta 11-14, così fa la richiesta di produzione di massa di iPSCs di alta qualità. E &#39;ampiamente citato che tra le altre malattie, l&#39;infarto miocardico o la sostituzione funzionale b-cellule richiederanno centinaia di milioni di miliardi di IPSC derivate cellule somatiche 15 - 18. Modellazione 3D dei tessuti, inoltre, sempre più complesso per la scoperta di farmaci e therapy chiederemo gran numero di cellule 9,13,19. In tutti questi esempi, definiti, uniforme e iPSCs riproducibili devono essere disponibili e semplice da produrre. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. La produzione in scala di iPSCs si è concentrata sulla coltura in sospensione 20 - 25 o sospensione con l&#39;utilizzo di substrati microcarrier 26-28 anche perché queste tecniche vengono distribuiti con successo su larga scala, non IPSC, produzione con sede eucarioti. Diversi gruppi hanno dimostrato sistemi di coltura sospensione che producono cellule staminali pluripotenti 20,21,23,24,29. Tuttavia, questi approcci utilizzano sistemi costosi e complessi non immediatamente disponibili ai ricercatori in via di sviluppo programmi di differenziazione romanzo, guidando l&#39;ingegneria dei tessuti e facendo laboratricerca ory scala. Inoltre, sospensione e microcarrier IPSC culture richiedono un adeguamento e di tecniche o prodotti chimici che non si trovano in cultura tradizionale aderente iPSC come l&#39;uso continuo di inibitore di Rho-chinasi, agenti antischiuma e filtrazione per regolare aggregazione. Lo stress fisico alle cellule è più prevalente in coltura in sospensione, introdotto mediante agitazione meccanica e durante microcarrier collisione. Questi problemi limitano la prevedibilità e la velocità con cui appena generato linee di cellule staminali possono essere coltivate in sospensione. Altri hanno sviluppato sistemi di movimentazione piastra robotici che imitano piastra tecniche di coltura 30,31 ma queste piattaforme richiedono significativi investimenti per attrezzature e competenze per operare in aggiunta alle sfide fondamentali associati alla cultura di cellule staminali. Il seguente lavoro descrive lo sviluppo e la pratica di una soluzione scalabile sistema di coltura IPSC che utilizza un liquido robotica 8 canali standard di self-containedpiastre gestore e 96 pozzetti. Questo metodo è stato progettato per colmare scala di laboratorio cultura IPSC e ad alto volume di produzione IPSC (ad esempio, 10 7-1,5 x 10 9 cellule per settimana a tecnico) che permettono quelle sviluppo di nuove tecnologie IPSC di scalare facilmente la produzione senza grandi investimenti hardware o di lavoro. Questo metodo è relativamente poco costoso da installare, richiede poco o nessun coltura di cellule staminali, programmazione o ingegneria esperienza, ha un ingombro apparecchiatura senza la necessità di una cappa di coltura cellulare dedicato, e utilizza attrezzature di coltura cellulare standard per consentire medio ad alto rendimento automatizzato la produzione di cellule. L&#39;obiettivo era quello di sviluppare un sistema in grado di coltura di cellule staminali scalabile che può essere utilizzato da laboratori nuovi per arginare coltura cellulare, coloro che trovano la coltivazione manuale una barriera per sviluppare le proprie idee o coloro che desiderano un mezzo economico per la produzione di un gran numero di cellule staminali. La piattaforma presentata qui rimuove influenza tecnico sustaminali coltura cellulare e normalizza le modalità di alimentazione e di passaggio per consentire la produzione di cellule staminali coerente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Avanzamento continua in coltura di cellule staminali pluripotenti sta chiudendo il gap tra panchina e comodino per l&#39;utilizzo di queste cellule nella medicina rigenerativa, scoperta di nuovi farmaci e test di sicurezza. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. Manutenzione di pluripotenza e prestazioni stabili delle cellule in applicazioni a valle (ad esempio, la differenziazione cellulare) nel tempo è fondamentale per la produzione di cellule su larga scala. Tuttavia che può essere difficile da raggiungere, soprattutto se le cellule sono coltivate manualmente quando l&#39;operatore può introdurre una significativa variabilità così come essere proibitivo in scala-up. Per abilitare high-throughput, su larga scala la produzione di cellule staminali e rimuovere l&#39;influenza dell&#39;operatore protocolli di coltura cellulare romanzo staminali utilizzando un banco multicanale movimentazione robot liquido sono stati sviluppati che richiedono il coinvolgimento tecnico minima o esperienza. Conqueste cellule staminali pluripotenti indotte umane protocolli (iPSCs) sono state coltivate in condizioni di assenza di alimentazione direttamente da un magazzino congelati e conservati in piastre da 96 pozzetti. A seconda linea cellulare e tasso scale-up desiderato, l&#39;operatore può facilmente determinare quando il passaggio sulla base di una serie di immagini che mostrano le densità colonia ottimali per spaccare. Poi i reagenti necessari sono pronti per eseguire una colonia divisione di nuove piastre senza una fase di centrifugazione. Dopo 20 passaggi (~ 3 mesi), due linee IPSC mantenuto cariotipi stabili, hanno espresso marcatori di cellule staminali, e differenziate in cardiomiociti ad alta efficienza. Il sistema può effettuare la successiva high-throughput screening di nuovi protocolli di differenziazione o la manipolazione genetica progettati per piastre a 96 pozzetti. Questa tecnologia consentirà di ridurre il carico di lavoro e tecniche per la produzione di un gran numero di cellule staminali identiche per una miriade di applicazioni.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.4K Views.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that adheres to form the midline epithelial seam (MES). The theories suggest that MES cells follow an epithelial to mesenchymal transition (EMT), apoptosis and migration, making a fused palate 1. Complete disintegration of the MES is the final essential phase of palatal confluence with surrounding mesenchymal cells. We provide a method for palate organ culture. The developed in vitro protocol allows the study of the biological and molecular processes during fusion. The applications of this technique are numerous, including evaluating responses to exogenous chemical agents, effects of regulatory and growth factors and specific proteins. Palatal organ culture has a number of advantages including manipulation at different stages of development that is not possible using in vivo studies.

Studies of palate development are motivated by the incidence of cleft palate, a birth defect that imposes a tremendous health burden and can leave lasting disfigurement. We demonstrate here a technique to culture palatal shelves that can be used to study different signaling pathways involved in palatal development and fusion.

Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...