The authors do not have any acknowledgements.

Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l&#39;uso di animali vertebrati, tra cui l&#39;approvazione preliminare da parte del Comitato Istituzionale cura degli animali e l&#39;uso locale. 1. Preparazione di dissezione Strumenti e cultura dei media <ol><li> Prelavaggio tutti gli strumenti da utilizzare in dissezione con 3% di perossido di idrogeno e quindi in autoclave a 121 ° C per 20 min. Filtro mezzi BGJb con soluzione antibiotica e antimicotica usando un filtro pori di dimensioni di 0,22 micron con aspirazione di vuoto in una cappa. </li></ol> 2. Preparazione di apparecchiature Cultura <ol><li> Tagliare filtri a membrana di policarbonato che sosterranno gli organi palatali in piccoli triangoli, spruzzare con il 70% di alcol e lasciare asciugare. Preparare Centro-Well Culture Organ piatto (60x15 mm) inserendo una griglia pulito e sterilizzato equilatero triangolare fili (20 mm) sopra la piastra di coltura organo. Quindi riempire il pozzo con 1 ml di BGJB mezzi di coltura. NOTA: il materiale dovrebbe essere sufficiente a raggiungere il livello della griglia senza immergere il palato. Posizionare i filtri a membrana, lato lucido verso il basso, sulla parte superiore della griglia (3-4 membrane per griglia) .Depending all&#39;esperimento, trattamento (proteine, anticorpi o inibitori) possono essere aggiunti ai media </li></ol> 3. mouse embrioni Raccolta e preparazione per la Cultura <ol><li> Per ottenere wild type embrioni di topo, uso cronometrato 13.5 incinta CD-1 topo background genetico sforzo. Pulire l&#39;area dissezione con il 70% di etanolo. NOTA: Altri ceppi di topi possono essere usati. Preferiamo topi CD-1 a causa del numero più grande lettiera. </li><li> Euthanize topi in gravidanza a E13.5 DPC (giorni dopo il coito) con il 5% isoflurano seguita da dislocazione cervicale per assicurare la morte utilizzando protocolli approvati. </li><li> Spray etanolo al 70% sulla superficie ventrale addominale per evitare che il bastone capelli addominale agli strumenti. Quindi aprire la cavità addominale ventraleutilizzando un spigolo smussato forbici operativi e pinze micro-dissezione per individuare l&#39;utero. Utilizzando le pinze, sollevare l&#39;intero utero e separarlo dal corpo tagliando al corpo uterino e alle punte delle corna uterine con una luce forbici operativi. </li><li> Posizionare l&#39;utero su un tovagliolo di carta pulito sul ghiaccio (Secondo la guida protocollo per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio). Coprire l&#39;utero con un altro tovagliolo di carta pulito per evitare contaminazioni. Sterilizzare gli strumenti utilizzando etanolo al 70% spray prima di utilizzare ulteriormente. L&#39;utero e gli embrioni possono essere trasportati al laboratorio in ghiaccio. </li><li> In una cappa a flusso laminare aperto, fare attenzione una piccola apertura nel sacco vitellino con le forbici affilate operativi-smussato e pinze micro-dissezione. Rendere l&#39;apertura più ampia e quindi spingere delicatamente per esteriorizzare l&#39;embrione dal sacco vitellino. </li><li> Trasferire immediatamente gli embrioni di una capsula di Petri con freddo tampone fosfato Saline 1X (PBS) pH 7,4. Per assicurare la corretta fase, exammina dell&#39;embrione sotto un microscopio da dissezione per il corpo, dimensione della testa e degli arti morfologia. NOTA: Gli embrioni che non sono in fase di sviluppo destra non vengono utilizzati per l&#39;esperimento. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> Figura 2. Arto Bud Morfologia. La parte anteriore e arti posteriori sono controllati per il grado di cinghia rientro tra le cifre. A E13.5, tutte le condensazioni cifre sono importanti, con il nastro e rientranze distale tra le cifre che appaiono molto distinto. Le cifre posteriori sono alle spalle da una mezza giornata 12 Riga superiore:. Zampa anteriore, inferiore fila: arti posteriori. 4. Palate Dissection <ol><li> Collocare un embrione alla volta in una capsula di Petri con PBS al microscopio da dissezione. Utilizzo di forbicine e pinzette dissezione separare la testa dal corpo degli embrioni. </li><li> Tenendo attentamente il cranio del mouse sopra il livello degli occhi con una pinza (evitandoil processo mascellare) fare due incisioni su entrambi i lati della linea del labbro. Quindi rimuovere la mandibola e la lingua. Isolare la regione mascellare processo effettuando un taglio a livello degli occhi e rimuovere il cervello, gli occhi, setto nasale e del tessuto adiacente. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> Figura 3. Palato tessuti raccolti da 13,5 embrioni, quando gli scaffali palato erano elevati, ma non in contatto. I ripiani palatali sono stati messi in coltura d&#39;organo su un filtro a livello di interfaccia multimediale ad aria per 72 ore nel modello statico. (A) Livello di dissezione su E13.5 embrione. (B) Blu stelle delimitare aree di tenere il tessuto con una pinza durante la dissezione. (C) Veduta di scaffali palatali sezionato posti su una membrana filtrante trapezoidale. (D) Vista laterale del piatto cultura dopo il posizionamento della palati sezionato e l&#39;aggiunta di coltura. <ol start="3"><li> Posizionare il lato orale palatina e rimuovere il setto nasale e il tessuto circostante, mantenendo il palato primario collegato per aiutarlo a orientarsi da anteriore a posteriore. Utilizzare una spatola cucchiaio e trasferire con molta attenzione gli scaffali palatali (lato nasale giù) per i filtri preparate sulle griglie nei piatti di coltura. NOTA: Regolare il volume dei mezzi di comunicazione per consentire una corretta interfaccia aria-media. </li><li> Al microscopio stereo, sezionare il palato primario e utilizzare una pinzetta per posizionare gli scaffali palatali vicini l&#39;uno all&#39;altro. Gli scaffali palatali non fondere se non vengono posti a contatto. Tagliare il filtro a membrana triangolare in cui si trova la parte anteriore del palato. La forma trapezoidale sarà di aiuto nel localizzare la porzione anteriore del palato. </li><li> Cultura scaffali singolarmente o con due o tre nello stesso piatto cultura organistica utilizzando BGJb coltura palatali. </li></ol> 5. Ripiani Coltura mouse palatali <ol><li> Incubare la tissues a 37 ° C in una miscela di gas umidificato (5% di CO 2 e il 95% di aria) per 72 ore, e cambiare il mezzo di ogni 24 ore. </li></ol> 6. Palate di elaborazione per l&#39;analisi istologica <ol><li> Fissare i palati dopo 72 ore di cultura con il 4% di formaldeide / tampone fosfato salino O / N a 4 ° &#160; C. Poi, delicatamente con una pipetta di trasferimento lavare il tessuto nel piatto cultura con PBS. Avvolgere i palati in un pezzo di salviette di laboratorio e luogo di incorporamento cassette. NOTA: Spostamento i palati di salviettine laboratorio prevenire la loro perdita durante il processo di disidratazione. </li><li> Disidratare il tessuto seguente 70%, 80% e fino al 100% lavaggi etanolo per 1 ora, seguito dalla procedura paraffina regolare. Per incorporare, posizionare la parte anteriore del palato rivolto verso il vassoio. </li><li> Tagliare seriali 6 sezioni micron con l&#39;orientamento coronale da anteriore a posteriore. Una sezione palato completa sarà resa 350-450 sections. Macchiare le sezioni con ematossilina eosina (H &amp; E). 10 Nota ogni 20 ° sezione utilizzando il già descritto medio Fusion Score (MFS) Scala (Tabella 1). 8 </li></ol>

<ol>
	<li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question.">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li><li>Strong, E. B., Buckmiller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+the+cleft+palate.">Management of the cleft palate.</a> Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).</li><li>Witt, P. D., Marsh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+assessing+outcome+of+surgical+repair+of+cleft+lip+and+cleft+palate.">Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate.</a> Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).</li><li>4miloro, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).</li><li>Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+epithelial+adhesion+molecule+CEACAM1+is+important+for+palate+formation.">Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation.</a> PloS one. 8, e61653 (2013).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro+an+analysis+by+DiI+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy.</a> Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).</li><li>Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+cultured+palatal+shelves+from+alligator+chick+and+mouse+embryos.">Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos.</a> The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).</li><li>San Miguel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin+reverse+signaling+controls+palate+fusion+via+a+PI3+kinase+dependent+mechanism.">Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).</li><li>Kang, P., Svoboda, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI+3+kinase+activity+is+required+for+epithelial+mesenchymal+transformation+during+palate+fusion.">PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).</li><li>RD, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , (1965).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Taher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+murine+limb+development.">Global gene expression analysis of murine limb development.</a> PloS one. 6, e28358 (2011).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests.

Il protocollo in questo articolo fornisce un metodo di dissezione scaffali palatali da embrioni al giorno embrionale 13.5. Ripiani palatali da embrioni di topo sono state coltivate in una coltura privo di siero in una atmosfera di 95% O 2 5% CO 2 a 37 ° C. Dissezione palatale di successo è criticamente dipendente da molteplici fattori ad ogni passo durante la procedura dal momento embrionali dei topi sacrificati al completamento della cultura. Uno dei fattori più importanti che influenzano palatale fusione...

Schisi oro-facciali sono i difetti di nascita cranio-facciali più predominanti. Inoltre, prendendo in considerazione tutti i possibili difetti cranio-facciali, questi sono i seconda anomalia nascita più comune nei neonati 2. Labbro leporino si verificano in circa 1 ogni 700 nascite negli Stati Uniti (US) ogni anno, l&#39;incidenza di palatoschisi è pari a 475 bambini nati con labbro leporino al mese o 15 bambini con crepacci al giorno 3. Circa l&#39;1% dei bambini nati in tutto il mondo ogni anno mostra una qualche forma di dismorfologia cranio-facciale. Clefts del palato e il labbro bisogno di una procedura molto costosa e complicata, con implicazioni permanente per i pazienti che hanno questa anomalia. Il costo stimato per ogni paziente con schisi orale è di circa 100.000 $ 4. Il trattamento di un paziente con labiopalatoschisi richiede un team di medici, tra cui cranio-facciali, chirurghi otorinolaringoiatri, genetisti, anestesisti,discorso in lingua patologi, nutrizionisti, ortodontisti, protesisti, psicologi, neurochirurghi, e oftalmologi. Nel palatogenesis, il palato secondario si pone come escrescenze accoppiati, che inizialmente si sviluppano verticalmente e subiscono elevazione mensola palatale sopra il dorso della lingua. A seguito di elevazione, gli scaffali palatali appaiati crescono verso la linea mediana (a E14.5 -E15 nei topi e negli esseri umani settimana 9). L&#39;epitelio bordo mediale (MEE), che copre la punta mensola aderisce formando la cucitura linea mediana epiteliale. Segue la transizione epitelio mesenchimale e / o apoptosi consentire mesenchimali confluenza. Adesione di opporsi MEE è un evento essenziale la cui alterazione provoca palatoschisi. Tuttavia, solo pochi studi hanno esaminato l&#39;adesione iniziale dei ripiani palatali 5. Le forme palato duro di differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti. Lo sviluppo anormale del palato in grado di produrre cleft palati con o senza coinvolgimento del labbro. Tecniche di coltura di organi palato erano stati utilizzati ampiamente per molti laboratori nel corso degli ultimi 30 anni 6,7. In questo protocollo si descrive in dettaglio un metodo di dissezione palatale e della cultura d&#39;organo statica. Il vantaggio di una cultura organo immobile è che permette scaffali palatali di fondersi. Questa tecnica è stata utilizzata con successo nel nostro laboratorio per molti di fusione e di segnalazione esperimenti 8,9. Tuttavia l&#39;applicazione della tecnica è vasto e può essere utilizzato ogni volta che è richiesto sistema di coltura organo statico, compresa la valutazione della risposta agli agenti chimici esogeni, gli effetti dei fattori di crescita regolamentazioni di vari percorsi e proteine ​​specifiche. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> Figura 1. Topo Palatogenesis. Stadi di sviluppo del palato topi. (BF) ele Scansionemicrografie CTRON (SEM) del palato secondario, a volte sviluppo rappresentative. Le frecce rosse indicano: la parte iniziale di palatale adesione e fusione. Frecce gialle: punto per lo spazio tra i palati primarie e secondarie che spariranno dopo la fusione (ristampato da Kaufman 11 con il permesso di PLoS One).

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BGJb</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza Inc.</td>
			<td>17-602E</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td>100x15mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well organ culture dish</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>#353037</td>
			<td>60x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wire triangular grid</td>
			<td>Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate filter</td>
			<td>GE&#38; Water and Process Technologies</td>
			<td>K04BP04700</td>
			<td>Black 0.4 micron, 47 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>ZEISS&#160; Stemi SR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture hood</td>
			<td>NUAIRE Laminar Flow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Dumont Medical&#160;</td>
			<td></td>
			<td>#5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS14003-G</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>INS500086</td>
			<td>Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Microdissecting scissors</td>
			<td rowspan="2">Kent Scientific Corporation</td>
			<td rowspan="2">INS14127-G</td>
			<td rowspan="2">Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical currete (spoon spatula)</td>
			<td>Hu-friedy</td>
			<td></td>
			<td>CM 2/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector laboratory hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Incubator</td>
			<td rowspan="3">Thermo Scientific</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td>Farma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series11 water Jacket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10010-023&#160;</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic Light source</td>
			<td>Fiber-light&#160; Dolan-Jenner</td>
			<td>PL-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassette&#160;</td>
			<td>Statlab</td>
			<td>EC301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kim Wipes</td>
			<td rowspan="2">VWR</td>
			<td rowspan="2">470173-504</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of studying palatal fusion using static organ culture

Labio-palatoschisi sono tra i più comuni di tutti i difetti di nascita. Le forme secondarie palato dagli scaffali mesenchimali coperti di epitelio che aderisce a formare la linea di giunzione linea mediana epiteliale (MES). Le teorie suggeriscono che le cellule MES seguono una epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), l&#39;apoptosi e la migrazione, per un palato fuso 1. Completa disintegrazione delle MES è la fase finale di essenziale palatale confluenza con circostante cellule mesenchimali. Forniamo un metodo per la cultura organo palato. Il protocollo sviluppato in vitro permette lo studio dei processi biologici e molecolari durante la fusione. Le applicazioni di questa tecnica sono numerosi, incluse le risposte di valutazione agli agenti chimici esogeni, effetti di fattori di regolazione e di crescita e proteine ​​specifiche. Cultura organo palatale ha una serie di vantaggi tra cui manipolazione a diversi stadi di sviluppo che non è possibile utilizzare in studi in vivo.

La tecnica può essere applicata a diversi tipi di experiments.The seguente studio è stato progettato per testare l&#39;effetto teratogeno della nicotina in vitro su palatale fusione. Due ceppi di topi sono stati utilizzati per questo esperimento, CD1 e tessuti C57.Palatal stata trattata con concentrazioni di nicotina emisolfato 0,06 e 6 mm. È stato osservato che i modelli di fusione palatali e tempi erano differenti nei due ceppi diversi. Nei topi CD1, mensole palatale del gruppo di controllo hanno continuat...

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Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Gli studi di sviluppo palato sono motivate dalla incidenza di palatoschisi, un difetto di nascita che impone un onere sanitario enorme e può lasciare deturpazione duratura. Si dimostra qui una tecnica per scaffali cultura palatali che possono essere utilizzati per studiare diverse vie di segnalazione coinvolti nello sviluppo del palato e fusione.

Metodo di studio palatale Fusion utilizzando Statico Cultura Organo

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.7K Views.  Texas A&M University Baylor College of Dentistry.  Gli studi di sviluppo palato sono motivate dalla incidenza di palatoschisi, un difetto di nascita che impone un onere sanitario enorme e può lasciare deturpazione duratura. Si dimostra qui una tecnica per scaffali cultura palatali che possono essere utilizzati per studiare diverse vie di segnalazione coinvolti nello sviluppo del palato e fusione. 

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Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

The use of reporter mice coupled to whole mount and section staining, microscopy and in vivo assays facilitates the analysis of mechanisms underlying the normal patterning of the respiratory tract. Here we describe how these techniques contributed to the analysis of Wnt signaling during tracheal development.

Studiare Wnt segnalazione Durante Patterning di condurre Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion is the merger of two or more cells to form a single cell. Here we provide a protocol for cell fusion of two different cell types. Fused hybrid cells are enriched by flow cytometry-based sorting, followed by fluorescence microscopy of hybrid cell structure and function. Fluorescently tagged proteins generated by genome editing are imaged inside fused cells, allowing cellular structures to be identified based on fluorescence emission and referenced back to the cell type of origin. This robust and general method can be applied to different cell types or organelles of interest, to understand cellular structure and function across a range of fundamental biological questions.

The purpose of this protocol is to fuse two different cell types to create hybrid cells. Fluorescence microscopy analysis of fused cells is used to track the cell of origin of cellular organelles. This assay can be used to explore how cellular structure and function respond to perturbation by cell fusion.

Fusione cellulare di linee cellulari modificate per la perturbazione della struttura cellulare e della funzione

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...