Le cellule staminali pluripotenti indotte, come le cellule staminali embrionali umane, possono differenziarsi in quasi tutte le cellule del corpo e quindi sono molto promettenti nel campo della medicina rigenerativa.
Le cellule staminali embrionali umane, o hESC, sono ottenute da embrioni preimpianto, mentre le cellule somatiche completamente differenziate vengono utilizzate per generare cellule staminali pluripotenti indotte, che sono anche denominate iPSC.
In questo video, imparerai a conoscere i principi di base alla base della generazione di iPSC, un protocollo passo-passo per indurre la pluripotenza nelle cellule differenziate e alcune delle molte applicazioni e modifiche a valle di questo protocollo.
Iniziamo discutendo i principi alla base della generazione di iPSC da tipi di cellule somatiche.
Le cellule differenziate, come le cellule della pelle o i neuroni, sono quelle il cui destino è deciso. Si impegnano a svolgere una particolare funzione. D'altra parte, le cellule staminali pluripotenti sono quelle il cui destino è indeciso e possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula.
Il processo di cambiamento dell'identità di una cellula già differenziata in uno stato pluripotente è chiamato riprogrammazione cellulare. Ciò comporta la modifica del modello di espressione genica nella cellula, perché il numero e i tipi di proteine prodotte da una cellula svolgono un ruolo importante nella definizione dell'identità di una cellula.
Uno dei modi per indurre la riprogrammazione cellulare è indurre l'espressione di alcuni fattori di trascrizione. I fattori di trascrizione sono proteine che si legano a sequenze regolatorie all'interno di un gene. Alcune di queste sequenze sono chiamate "promotori" e quindi promuovono la trascrizione di un gene. Alcuni fattori di trascrizione possono influenzare l'espressione di numerosi geni, il che ha un enorme impatto sull'identità cellulare.
I quattro fattori di trascrizione classici che hanno dimostrato di indurre la pluripotenza sono Oct4, Sox2, cMyc e Klf4. Questi fattori sono anche noti come fattori Yamanaka, dal nome del ricercatore che ha scoperto i loro effetti di riprogrammazione.
Più metodi possono essere utilizzati per indurre l'espressione di questi fattori di trascrizione. Il metodo più comune ed efficiente è l'uso di un virus modificato per fornire i geni del fattore di trascrizione nel nucleo, dove si integreranno nel genoma.
In questo metodo, i geni che codificano per i quattro fattori Yamanaka sono confezionati individualmente in diversi retrovirus e aggiunti a cellule differenziate. Quando le cellule sono esposte a virus modificati, una piccola frazione di cellule differenziate viene infettata da tutti e quattro i virus che trasportano il fattore di trascrizione. Iniziano a dedifferenziarsi fino a formare grandi gruppi sferici di cellule staminali pluripotenti. La formazione di cluster aiuta le iPSC a creare un microambiente simile alle cellule staminali in vivo e quindi ad aiutarle a mantenere la loro pluripotenza.
Dal momento che ora comprendi i principi di base alla base della generazione di iPSC, passiamo attraverso un protocollo generale per indurre la pluripotenza nei fibroblasti embrionali di topo, o MEF, utilizzando un sistema di trasduzione virale.
Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo, quindi seguire le linee guida di sicurezza è estremamente importante.
Per iniziare il processo di trasfezione, il terreno di coltura viene rimosso da una piastra contenente un'alta densità di MEF e le cellule vengono lavate con una soluzione tampone. Successivamente, viene aggiunta una soluzione contenente un enzima che degrada le proteine, come la tripsina, per sollevare le cellule dal fondo del piatto. Il terreno di coltura viene quindi aggiunto alla piastra e le cellule staccate vengono trasferite in un tubo centrifugo.
Dopo la centrifugazione, il pellet viene ri-sospeso nel terreno di coltura. Successivamente, le cellule vengono contate e la concentrazione viene regolata in modo che un numero ottimale di cellule possa essere infettato dal virus il giorno successivo. Incubare le cellule durante la notte.
Dopo che le cellule si sono depositate sul loro nuovo piatto, i vecchi media vengono sostituiti da mezzi freschi e i virus ingegnerizzati contenenti i fattori di trascrizione desiderati vengono aggiunti alla piastra. Le cellule vengono quindi incubate con i virus per un tempo sufficiente a consentire l'infezione. Dopo l'incubazione, il mezzo contenente virus liberi viene rimosso e sostituito con un mezzo di cellule staminali embrionali fresche.
Per 2-3 settimane dopo la trasformazione, le cellule devono essere coltivate a 37° in un incubatore e i mezzi di coltura devono essere sostituiti quotidianamente.
Dopo questo periodo di tempo, le colonie di iPSC che sembrano simili alle colonie di cellule staminali embrionali dovrebbero diventare abbastanza grandi da essere raccolte. Le colonie possono essere trasferite in un piatto fresco contenente terreno con fattori di crescita appropriati e lasciate crescere ulteriormente. Al fine di confermare la pluripotenza, una parte della popolazione cellulare è macchiata con marcatori di pluripotenza.
Ora che hai visto come generare iPSC da celle differenziate, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni a valle e modifiche di questo metodo molto utile.
Una caratteristica importante delle iPSC è che possono essere utilizzate per generare quasi tutte le cellule del corpo. Questo esempio mostra la generazione di cellule del muscolo cardiaco, chiamate cardiomiociti, da iPSC. Per fare ciò, le iPSC vengono trasferite in placche non aderenti che consentono loro di formare corpi embrioidi, che sono aggregati di cellule staminali pluripotenti. I corpi embrioidi vengono coltivati in un mezzo specializzato contenente siero e acido ascorbico, che migliora la differenziazione cardiaca. La differenziazione di successo può essere facilmente osservata quando alcune cellule iniziano a battere.
Poiché le iPSC possono potenzialmente differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, possono anche formare un intero organismo, come un topo. Questo può essere fatto usando un test chiamato complementazione tetraploide. In primo luogo, un embrione tetraploide, un embrione contenente quattro serie di cromosomi, si forma fondendo insieme due cellule di un embrione precoce utilizzando un campo elettrico. L'embrione tetraploide è autorizzato a svilupparsi allo stadio di blastocisti. Le iPSC vengono quindi iniettate nella blastocisti, che viene poi trapiantata in una femmina ricevente per la gestazione. Le cellule tetraploidi sono in grado di formare solo strutture extraembrionali come la placenta, quindi gli animali risultanti da questo metodo sono derivati interamente dalle iPSC.
Alcuni ricercatori modificano la procedura di riprogrammazione per rendere più efficiente il processo di identificazione delle cellule riprogrammate con successo. Ad esempio, in questo esperimento i MEF con la capacità di esprimere proteine fluorescenti verdi sotto l'influenza del promotore Oct4 hanno aiutato i ricercatori a identificare facilmente le cellule che hanno acquisito pluripotenza.
Hai appena visto il video di JoVE sulla generazione di cellule staminali pluripotenti indotte. Questo video ha esaminato i principi alla base di questa procedura e un protocollo passo-passo per generare iPSC da cellule differenziate. Abbiamo anche esaminato come questo metodo potrebbe essere applicato o modificato per esperimenti in laboratorio.
La scoperta delle iPSC ha avuto un enorme impatto sul campo della biologia delle cellule staminali, poiché ha un enorme potenziale per lo sviluppo di terapie che possono essere impiegate per trattare i disturbi degenerativi. Sebbene siano stati fatti molti progressi con le iPSC, l'ostacolo che deve ancora essere superato è il rischio associato di cancro. Le attuali procedure di riprogrammazione hanno il potenziale per provocare una crescita cellulare non regolata che può provocare il cancro. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per utilizzare effettivamente le iPSC clinicamente. Come sempre, grazie per aver guardato!
