Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dalla Fondazione Bettencourt Schueller a sostegno della squadra di Parigi Bettencourt iGEM. Ringraziamo l&#39;unità di ricerca INSERM U1001 e Chantal Lotton per l&#39;assistenza tecnica e consulenza. Fagemidi Litmus28i_J23115-B0032-GFP è stato fornito da Monica Ortiz e Drew Endy della Stanford.

1. Progettazione e Costruzione di fagemide Vettori cuscinetto sRNA Silencing Cassette <ol><li> De Novo Progettazione di Srna silenziatori cassette 8 <ol><li> Identificare la sequenza completa del mRNA per essere silenziato utilizzando un database di sequenze di DNA. Per generare la sequenza bersaglio, si noti il primo 24 bp della sequenza codificante, dalla posizione 1-24 a partire dal codone di inizio (ad esempio, ATG). Nota: silenziamento è meno efficiente quando altri siti o segmenti di mRNA sono mirati 8. </li><li> Prendere il complemento inverso della sequenza bersaglio per produrre la sequenza GUIDA per la cassetta sRNA. Vedi Tabella 1 per esempi di Target e guida sequenze per cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). </li><li> Per progettare il 292 bp espressione sRNA completa cassetta, organizzare Pr promotore, sequenza GUIDA, Hfq proteina dominio di legame e T1 / TE sequenze di terminazione di trascrizione in serie (Tabella 2). </li><li> Aggiungere ulteriori siti di clonazione di scelta per facilitare la clonazione della cassetta sRNA nel vettore di destinazione. </li><li> Ottenere la cassetta completa sRNA attraverso la sintesi del gene commerciale o un metodo simile e clonarlo in ogni vettore fagemidi con una origine di replicazione f1 funzionale 11. Vedere informazioni di supporto per la sequenza completa del vettore fagemide finale. </li></ol></li><li> Alterare la sequenza di mira da un cassetto sRNA Expression esistente utilizzando Site PCR-based Directed Mutagenesi 12 <ol><li> Identificare la sequenza GUIDA 24 bp in una cassetta di espressione sRNA esistente. Nota: Il plasmide pAB.001 annotato, utilizzato in questo lavoro, è disponibile come file di sequenza supplementare. </li><li> Progettazione primer con brevi regioni di omologia alla cassetta sRNA esistente che fiancheggia la nuova sequenza GUIDA 24 bp in avanti e indietro. Ottenere i primer attraverso la sintesi di oligonucleotidi commerciale. Nota: progettazione Primer per mutagenesi sito-diretta è depicTed in Figura 2. sequenze di modelli di primer esatta sono riportati nella Tabella 3. </li><li> Preparare una cultura 5 ml di E. coli che trasportano il fagemide modello sRNA espressione. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. </li><li> Estrarre e purificare l&#39;espressione fagemide modello sRNA dalla coltura batterica 5 ml utilizzando un kit miniprep DNA o metodo simile 12. </li><li> Preparare due reazioni PCR utilizzando il fagemide template sRNA espressione e alta fedeltà polimerasi, una con l&#39;avanti e uno con il primer reverse (Tabella 4). Utilizzare condizioni di PCR come raccomandato dal fornitore polimerasi (Tabella 5). Aumentare la concentrazione modello per 10-50x superiore ad una reazione normale per tenere conto del fatto che la reazione singolo innesco non produce l&#39;amplificazione esponenziale. </li><li> Unire le due reazioni PCR di cui sopra in una provetta. Annealitro, i prodotti di riscaldamento a 98 ° C in un bagno di acqua bollente. Immediatamente dopo aver piazzato la provetta nel bagno d&#39;acqua, rimuovere la fonte di calore e lasciare il bagno per tornare lentamente alla temperatura ambiente per 1-2 ore. </li><li> Per eliminare l&#39;immutata modello sRNA espressione fagemidi, aggiungere 1 ml. DpnI enzima di restrizione al composto e incubare a 37 ° C per 1 ora, o il tempo raccomandato dal produttore per completa digestione. Nota: DpnI digerisce siti bersaglio solo denaturato, che sono presenti sul fagimidi host replicato, ma non i prodotti di PCR. </li><li> Transform acquistati o preparati 13 chimicamente competente E. coli con 1-5 ml di prodotto PCR ricotto. Isolare singole colonie del ceppo trasformato dalla placcatura selettiva su piastre di agar LB contenenti antibiotici appropriati. </li><li> Per verificare l&#39;incorporazione della sequenza GUIDE corretta, schermare le colonie risultanti da colonia PCR. Usando una punta della pipetta 200 microlitri, collect una piccola quantità di cellule da una singola colonia trasformata. Marco e preservare la colonia originale per l&#39;uso a valle dopo la verifica. </li><li> Aggiungere le cellule raccolte a 50 ml di acqua priva di nucleasi in una provetta. Mescolare pipettando su e giù. </li><li> Utilizzando un termociclatore banco o un bagno di acqua bollente, lisare le cellule mediante riscaldamento a 95 ° C per 2 min. </li><li> PCR-amplificare la regione fagemide usando 1 ml di cellule calore lisati come uno stampo di DNA. Condizioni di PCR e protocolli Thermocycler sono forniti nelle Tabelle 6 e 7. Vedere il file di sequenza pAB.001 supplementare per le sequenze di verifica di primer. </li><li> Sequenziare il prodotto di PCR per verificare l&#39;incorporazione della sequenza GUIDE corretta. </li><li> Inoculare una cultura 5 ml di E. clone coli che trasportano l&#39;espressione sRNA fagemide sequenza verificato. Crescere le cellule notte a 37 ° C con agitazione, in terreni selettivi LB. </li><li> Preparare uno stock di glicerolodel clone sequenza verificato. Aggiungere 750 ml di cultura durante la notte a 250 ml di 60% glicerolo in una provetta crio tappo a vite. </li><li> Conservare lo stock di glicerolo a -80 ° C a tempo indeterminato. Il resto della cultura durante la notte può essere utilizzato come fonte per l&#39;espressione fagemide sRNA nel passaggio 2. </li></ol></li></ol> 2. Produzione e raccolta di titoli fagemide M13-confezionati <ol><li> Preparare una cultura 5 ml di E. coli che trasportano l&#39;espressione fagemide sRNA. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. Nota: L&#39;espressione fagemidi sRNA può essere ottenuto attraverso la clonazione de novo come descritto al punto 1.1.5, o modificato da un fagemide esistente e raccolta in fase 1.2.16. </li><li> Analogamente preparare una coltura 5 ml di E. coli che trasportano l&#39;assistente plasmide M13KO7. Crescere le cellule notte a 37 ° C con agitazione, in terreni selettivi LB. </li><li> Estrarre e purificare il expressio sRNAn fagemidi e plasmide helper utilizzando un kit di estrazione del DNA o un metodo simile 12. </li><li> Cotransform acquistato o preparato 13 chimicamente competenti di E. coli con 1 ml ciascuno di sRNA espressione fagemide e plasmide helper. Selezionare per cotransformants dalla placcatura in LB agar con antibiotici selettivi per entrambi i costrutti. </li><li> Preparare una cultura 10 ml da una singola colonia del ceppo cotransformed in LB con antibiotici selettivi. Incubare a 37 ° C con agitazione per 8-12 ore o durante la notte. </li><li> Centrifugare la coltura a 3.300 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron. Attenzione: in caso di fuoriuscita di supporti, pulire l&#39;area con diluito candeggina (0,5%) per distruggere particelle fagiche infettive. </li><li> Conservare il filtrato fagemide confezionato a 4 ° C. Nota: I campioni possono essere mantenuti per giorni o settimane, senza perdita di attività. </li></ol> 3. Preparazione di cellule F + obiettivo per tacere <ol><li> Determinare se le cellule devono essere mirati per tacere esprimono il pilus F 14. Se il pilus F è già presente, passare al punto 4. Nota: ceppi di laboratorio comuni di E. coli annotati come F + o F &#39;per indicare la presenza del pilus F nel loro genoma o su un plasmide. </li><li> Ottenere un ceppo F + di E. coli quali TOP10F &#39;. Nota: Assicurarsi che il ceppo bersaglio porta un marcatore di resistenza unica al fine di essere separato dal donatore F-plasmide dopo coniugazione. </li><li> Per introdurre F pilus da coniugazione con un ceppo F +, preparare 5 ml culture sia del ceppo bersaglio e donatore di F-14 plasmide. Crescere le cellule durante la notte a 37 ° C con agitazione, in LB media con antibiotici appropriati. </li><li> Il giorno seguente, diluire entrambi i ceppi 1: 100 in 5 ml di LB selettiva e continuare la coltura a 37 ° C con agitazione. </li><li> Determinare la fase di crescita delle cellule misurando la optDensità iCal della cultura a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro da banco. Coltivare le cellule per circa 2 ore, fino un OD 600 di 0,3 è raggiunto, indicando fase di crescita logaritmica 15. </li><li> Preparare le reazioni 3 coniugazione in provette da microcentrifuga: 0,5 ml F-plasmide ceppo donatore + 0,5 ml di destinazione, 0,5 ml F-plasmide donatore + 0,5 ml LB supporto (controllo negativo) e 0,5 ml di destinazione ceppo + 0,5 ml LB supporto (controllo negativo). Lasciare che la coniugazione di procedere per 2 ore a 37 ° C con agitazione. </li><li> Piastra 100 ml di ogni reazione di coniugazione sul selettivo agar LB con antibiotici specifici per l&#39;F-plasmide (tipicamente tetraciclina) e ceppo bersaglio. Piastra le reazioni di controllo negativo per confermare che né donatore o ricevente ceppo esprimono entrambe le resistenze agli antibiotici. </li></ol> 4. L&#39;infezione da fagimidi confezionato per tacere <ol><li> Inoculare una singola colonia di cellule bersaglio F + in una cultura 5 ml di LB mediuna con antibiotici appropriati. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione. </li><li> Il giorno seguente, diluire le cellule bersaglio F + 1: 100 in 5 ml di terreni selettivi LB e continuare a coltura a 37 ° C con agitazione. </li><li> Determinare la fase di crescita delle cellule misurando la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrofotometro da banco. Coltivare le cellule per circa 2 ore, fino un OD 600 di 0,3 è raggiunto, indicando fase di crescita logaritmica 15. Nota: L&#39;espressione della pilus e l&#39;infezione efficienza F è più alta in fase di log. </li><li> Aggiungere i fagimidi M13-confezionati (dal punto 2.6) alle cellule bersaglio in un rapporto in volume di 1: 100 per ottenere l&#39;infezione quasi il 99% della popolazione target. Lasciare che l&#39;infezione di procedere a 37 ° C con agitazione per 30-60 min. </li><li> Analizzare i fenotipo sRNA-silenziamento secondo il metodo di scelta. Nota: Per un bersaglio proteina fluorescente, l&#39;effetto di silenziamento può essere quantificatodirettamente fluorimetria 10. In alternativa, saggi fenotipici possono essere utilizzati per osservare le conseguenze fenotipiche di silenziamento genico 8. </li><li> Preparare uno stock di glicerolo per il sRNA esprimono ospite fagemidi seguendo i passaggi 1.2.14-1.2.16. Nota: il fagemide si propaga nel ceppo ospite indefinitamente e può essere mantenuto con antibiotico simile ad un plasmide convenzionale. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il presente metodo ha raggiunto riduzione del 80% dei livelli di fluorescenza mKate rispetto ai controlli mirati. Ciò è in linea con altri metodi di knockdown RNA, dove completa silenziamento non si osserva ed efficienza 50-90% è tipico 16,17. A livello fenotipico, atterramenti CAT mirati sono stati in grado di attenuare in modo significativo la resistenza cloramfenicolo, ed eliminarlo in alcune condizioni. Il fenotipo knockdown era rilevabile a livello di popolazione dopo poche ore post-infezione (Figura 3B). Questo illustra una caratteristica importante della consegna fago-based: una frequenza atterramento elevato può essere ottenuto direttamente in coltura batch senza previa modificazione genetica. A differenza di modificazioni genetiche convenzionali che utilizzano la trasformazione plasmide o l&#39;integrazione genomica, l&#39;infezione fagi non richiede che una popolazione sia nuovamente cresciuto da una singola colonia isolata. Questo permette gli effetti delle infezioni fago siano explorEd in popolazioni con dinamiche spaziali complessi 11, con strutture spaziali pre-esistenti, come biofilm 18, o in popolazioni naturali geneticamente misti 19. Un punto critico di questo metodo è la produzione di fagemide impaccato ad alto titolo. L&#39;onere metabolico associato alla produzione di fago di particelle può portare ad alto tasso di mutazioni o perdite plasmide nel ceppo produttivo fagemide. Si raccomanda che il fagemide ceppo produttivo essere coltivato direttamente da una singola colonia cotransformed e non refrigerati, congelati o sub-coltura prima del raccolto fago. Una scarsa efficienza di co-trasformazione può anche essere osservato nell&#39;introdurre il fagemide e helper plasmide di E. coli contemporaneamente. In questo caso, maggiori efficienze possono essere ottenuti trasformando il plasmide helper, poi la preparazione di cellule competenti recanti il ​​plasmide helper per la successiva trasformazione con il fagemide. Phainfezione gemid o l&#39;espressione sRNA impone anche un onere metabolica rilevabile sulle cellule bersaglio, e può comportare qualche perturbazione fenotipica. Per esempio, una riduzione mKate2 fluorescenza è stata osservata anche quando le cellule sono state infettate con un fagemide di targeting CAT (Figura 3). L&#39;infezione da M13 non è pensato per innescare risposte allo stress sistemici in E. coli 20, ma può alterare i modelli trascrizionale indirettamente. In alternativa, i marcatori GFP o di resistenza ampicillina inclusi sul fagemide possono competere per le risorse cellulari, riducendo espressione e di crescita 9 mKate2. Infine, la cassetta sRNA si può modificare a livello globale profili di espressione genica titolando la proteina Hfq, o tramite fuori bersaglio mRNA silenziamento. Bersaglio Effetti Off sono comuni in in vivo RNAi mira 21-23, ma hanno ancora essere indagato in modo sistematico per questo sistema. Una limitazione di questo metodo è che l&#39;effi infezionecienza è inferiore al 100%, consentendo alcuni batteri non infetti di persistere nella popolazione. I risultati di questo lavoro e di lavoro precedente 10 suggeriscono che le cellule non infette rappresentano il 1-10% della popolazione finale, e sono responsabili per la maggior parte dei fenotipi nonsilenced osservati. Una varietà di rotte per M13-resistenza sono noti, con il più comune è la perdita mutazionale di espressione pilus 24. Alla luce di queste limitazioni, i controlli devono essere utilizzati per confermare alti tassi di infezione e l&#39;efficienza atterramento. Un&#39;altra limitazione potenziale per alcune applicazioni è il trasferimento occasionale di contaminare helper fago. Sebbene M13K07 contiene un segnale di confezionamento mutato, può essere confezionato in fago capside a bassa frequenza e trasferito alle popolazioni infetti, con conseguente cellule competenti per la produzione di fago e la continua diffusione del fago oltre l&#39;evento infezione iniziale 25. Le modifiche al fago helper si sono dimostrati efficacia riduzione degli imballaggi non specifico, anche se a volte a costo di produzione ridotto fago 26. Batteriofago Engineered sono diventati uno strumento indispensabile per E. biologia sintetica coli, consentendo la consegna rapida di nuovi geni di una popolazione in crescita. Un recente lavoro ha prodotto circuiti di comunicazione intercellulare 11 o espresso fattori di trascrizione per sopprimere la resistenza agli antibiotici vie di diffusione 27. Il protocollo presentato qui aggiunge una crescente collezione di strumenti che permettono il controllo della fisiologia batterica attraverso RNA programmati. Nucleasi CRISPR-Cas, quando mutati per eliminare l&#39;attività nucleasi, hanno dimostrato di reprimere la trascrizione di geni a bersagli di RNA-guida 17,28. Al contrario, sRNA silenziamento funziona a livello traduzionale e non richiede l&#39;espressione della proteina esogena. biotecnologie di nuova generazione possono unire controllo trascrizionale e traslazionale con consegna fago mediata da programmare fenotipo complessotipi in tempo reale.

atterramenti geni RNA-mediata procedere in due fasi. Innanzitutto, una molecola di RNA viene introdotto ad una linea cellula o organismo di studio. In secondo luogo, endogeni RNA-binding proteins facilitare il riconoscimento di RNA-target e produrre l&#39;effetto di silenziamento. Tutte le tecnologie RNA knockdown beneficiano natura personalizzabile sRNAs sintetici, che può essere facilmente realizzato per corrispondere a un target specifico di interesse. Tuttavia, i dettagli molecolari di RNA assorbimento e silenziamento variano ampiamente tra sistema modello, vincolando dove e come abbattimenti di RNA possono essere applicati. In nematodi, RNA a doppio filamento (dsRNA) molecole può essere introdotto direttamente nei media o alimentando i vermi, con una popolazione di dsRNA che esprimono E. coli 1,2. In Drosophila, RNAi possono essere raggiunti microinjecting embrioni con dsRNA 3, o attuare linee cellulari semplicemente aggiungendo dsRNA al mezzo di coltura 4. In linee cellulari di mammifero,sintetici piccoli RNA interferenti (siRNA) possono essere consegnati alle cellule viventi mediante elettroporazione 1,2,5, confezionato in liposomi 3,6, o espressi da plasmidi DNA 4,7. Una volta che le specie di RNA raggiunge citosol, il percorso RNAi basa sul complesso RISC per elaborare dsRNA, agevolare il riconoscimento antisenso del bersaglio, e catalizzare la repressione traduzionale, degradazione dell&#39;mRNA, o la formazione di eterocromatina, in base all&#39;host. A causa di questi requisiti, classica RNAi può essere eseguita solo in organismi che occupano l&#39;RNA esogeno in modo efficiente ed esprimono RISC o un&#39;attività RISC-like. In particolare, questo esclude il modello batterio E. coli, che manca il percorso RNAi. Tuttavia, i recenti progressi nel campo della biologia sintetica forniscono gli strumenti per risolvere sia il problema di consegna e il problema silenziamento. In questo protocollo, costrutti Srna sono espressi in E. coli da un vettore DNA consegnato a LiVing cellule utilizzando il sistema fagemide / helper M13. Un fagemidi è un qualsiasi plasmide con un&#39;origine f1 fago-derivati ​​di replica. Un plasmide helper, in questo caso M13KO, porta tutti i macchinari necessari per produrre particelle virali, ma non si è competente per la replicazione e l&#39;imballaggio. Quando un fagemide e plasmide helper sono co-trasformati, il fagemide solo si replica all&#39;origine f1, confezionato e secreto. Il fagemidi vettorizzati è quindi competente per infettare dal vivo E. coli tramite il pilus F. In questo sistema, l&#39;effetto di silenziamento è prodotto da cassette Srna personalizzata combinando una sequenza ponteggio con una sequenza bersaglio vincolante. La sequenza bersaglio vincolante è di 24 paia di basi antisenso ad un target mRNA, in genere presso il sito ribosoma vincolante (RBS). La sequenza di impalcatura, sviluppato da Na e colleghi 8, contiene un motivo Hfq vincolante estratto da MICC, un piccolo RNA normativo endogena di E. coli. La proteina stimola Hfq RNA-RNA binding e la degradazione dell&#39;mRNA, che serve un ruolo in questo sistema simile a RISC in RNAi. La figura 1 illustra uno schema completo per abbattimenti Srna fago-mediata, compresa la struttura sRNA cassetta, vettorializzazione fagemidi, e il meccanismo di tacere. Come metodo per modulare l&#39;espressione genica in E. coli, sRNA silenziamento è semplice, rapida e versatile. Il E. mirato coli non è gravata di là di moltiplicazione del fagemide ed esprimendo la sRNA. Questo può essere rilevante nel contesto della biologia sintetica o di ricerca di base in cui l&#39;espressione di costrutti eterologhi più grandi può sforzare le risorse cellulari 9. Fagemidi nuovi bersagli possono essere prodotti con una singola PCR e raccolte un giorno dopo la trasformazione fagemide. Infine, quasi ogni mRNA può essere mirata. La regolazione cassette sRNA (su un plasmide standard) ha dimostrato di lavorare su una varietà di bersagli nel metabolismo con livelli tipici repressione&gt; 90% 8. 10. Innanzitutto, un fagemide confezionato viene introdotto ad una cultura lotto di E. coli e utilizzati per mettere a tacere l&#39;espressione della proteina fluorescente mKate2. cambiamenti di fluorescenza successivi sono monitorati in tempo reale. In secondo luogo, abbattendo il gene CAT è indicato per ridurre fenotipica resistenza al cloramfenicolo su piastre di agar. In entrambi i casi, il fagemide sé porta un marcatore GFP, permettendo tasso di infezione da misurare indipendentemente l&#39;efficienza knockdown.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="637">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td style="width:135px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DpnI Enzyme</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq 2x Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0270L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:135px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N0315S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOP10F&#39; Cells</td>
			<td style="width:135px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C3030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB Broth</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3022-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9393-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60615-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">87128-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated delivery of targeted srna constructs to knock down gene expression in e. coli

atterramenti RNA-mediata sono ampiamente utilizzati per controllare l&#39;espressione genica. Questa famiglia versatile di tecniche fa uso di breve RNA (sRNA) che può essere sintetizzato con qualsiasi sequenza e progettato per integrare qualsiasi genica mirata per silenziamento. Poiché sRNA costrutti possono essere introdotte per molti tipi di cellule direttamente o utilizzando una varietà di vettori di espressione genica può essere repressa in cellule viventi senza modificazione genetica laborioso. L&#39;RNA più comune tecnologia atterramento, l&#39;interferenza dell&#39;RNA (RNAi), si avvale della endogena di riconoscimento sequenza di RNA-induced silencing complex (RISC) di mediare e scissione del mRNA bersaglio. Le applicazioni di questa tecnica sono quindi limitati a organismi RISC che esprimono, in primo luogo eucarioti. Recentemente, una nuova generazione di biotecnologi RNA hanno sviluppato meccanismi alternativi per il controllo dell&#39;espressione genica attraverso RNA, e così reso possibile atterramenti geni RNA-mediata nei batteri. Qui si descrive un metodo per mettere a tacere Expres genesione in E. coli che assomiglia funzionalmente RNAi. In questo sistema un fagemide sintetica è progettato per esprimere sRNA, che può ad indirizzare qualsiasi sequenza. Il costrutto di espressione viene consegnato ad una popolazione di E. coli con non-litico M13 fago, dopo di che è in grado di replicare stabilmente come un plasmide. Riconoscimento antisenso e silenziamento del mRNA bersaglio è mediata dalla proteina Hfq, endogena di E. coli. Questo protocollo include metodi per progettare la sRNA antisenso, la costruzione del vettore fagemide, il confezionamento del fagemide in Fago M13, la preparazione di una popolazione di cellule dal vivo per l&#39;infezione, e l&#39;esecuzione l&#39;infezione stessa. La proteina fluorescente mKate2 ed il cloramfenicolo acetiltransferasi gene di resistenza agli antibiotici (CAT) sono mirati a generare dati rappresentativi e di quantificare l&#39;efficacia atterramento.

Silenziamento del mKate2 fluorescenza in mezzi liquidi La figura 1 illustra lo schema per abbattimenti sRNA-mediate descritti in questo lavoro, tra cui la progettazione sRNA cassetta, vettorializzazione fagemidi, e il meccanismo di silenziamento. A seguito di protocollo 1.2, il tacere cassette sRNA di plasmide pAB.001 è stato modificato per indirizzare mKate. La cassetta è stata sRNA sintetizzato e clonato in fagemidi Litmus28i_J23115-B0032-GFP, un dono di Monica Ortiz e Drew Endy 11. Questo fagemidi porta marcatori di espressione GFP e resistenza alla kanamicina, permettendo infezioni di successo per essere monitorati. scorte fagemidi confezionati sono stati preparati seguendo il protocollo 2. Un derivato di E. coli K12 MG1655 portando una, marcatore mKate2 cromosomicamente integrato costitutivamente espresso è stato preparato per l&#39;infezione fagi per coniugazione<html> con un ceppo plasmide donatore F seguente protocollo 3. Le cellule sono state coltivate per fase registro medio e il fagemide introdotto seguente protocollo 4. Dopo l&#39;infezione fagemidi, 200 microlitri culture sono stati trasferiti in un lettore di piastre a fluorescenza e fluorescenza è stata monitorata continuamente per 24 ore. La figura 3 mostra l&#39;effetto di silenziamento sRNA mediata sull&#39;espressione mKate2. Il ceppo infettati con un fagemidi anti-mKate2 non ha mostrato alcun rilevabile fluorescenza mKate2 su sfondo. Al contrario, questo ceppo ha fatto esprimere il marcatore GFP, che indica l&#39;assorbimento di successo del fagemide. cellule di controllo non infettate prodotte mKate2 fluorescenza, ma non GFP. Un ulteriore controllo, in cui il dominio di targeting anti-mKate2 è stata sostituita con una sequenza di targeting CAT, non ha avuto effetto sulla mKate2 fluorescenza. Mettere a tacere di resistenza al cloramfenicolo su piastre di agar contenuti &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A seguito di protocollo 1.1, una cassetta tacere sRNA è stato prodotto per indirizzare CAT Un derivato di E. coli K12 MG1655 portando un costitutivamente espresso, marcatore CAT cromosomicamente integrato è stato preparato per. infezione fagi mediante coniugazione con un ceppo donatore F-plasmide seguente protocollo 3. le cellule sono state coltivate a fase log media e il fagemide introdotto seguente protocollo 4. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C, le cellule infette sono stati diluiti e piastrate alla intervallo di concentrazioni cloramfenicolo. piastre sono state incubate durante la notte, e la percentuale di cellule resistenti a ciascuna concentrazione cloramfenicolo è stato determinato contando unità formanti colonie (CFU) il giorno successivo. La Figura 4 mostra l&#39;effetto di silenziamento sRNA mediata sul fenotipo resistenza al cloramfenicolo. Le cellule non infette, o cellule infettate con fagemidi mira mKate2, erano resistenti alcloramfenicolo a tutte le concentrazioni testate. Al contrario, le cellule infettate con fagemidi mira CAT mostrato una ridotta sopravvivenza a basse concentrazioni di cloramfenicolo, e quasi il 99% uccidendo a concentrazioni più elevate. L&#39;aggiunta di ampicillina, per selezionare solo i batteri che trasportano il fagemide, ha ridotto la sopravvivenza cloramfenicolo a livelli non rilevabili. Ciò è coerente con il lavoro precedente che dimostra che la fuga dalle infezioni fago è un percorso comune per sfuggire a tacere 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig1.jpg" /> Figura 1: silenziamento genico in E. coli con sRNA espressione cassette Consegnato da M13 fagi La cassetta sRNA è composto da 4 moduli:. Il promotore pr (un promotore costitutivo derivato dal batteriofago lambda), un 24 bp mira a dominio, un dominio di legame Hfq estratto da MICC e un terminatore trascrizionale 8 </sup&gt;. La cassetta è integrato in una phagemid recante l&#39;origine di replicazione f1 M13 e confezionato in capside M13 con il M13KO7 helper fago. Fagimidi Packaged sono in grado di infettare E. coli che esprimono il pilus F, dove inizia espressione sRNA. Il sRNA poi recluta la proteina Hfq (rappresentato in rosso) e si lega un target mRNA antisenso nei pressi del sito di legame ribosoma, con conseguente repressione traslazionale e degradazione dell&#39;mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig2.jpg" /> Figura 2:. Progettazione Primer e mutagenesi sito-diretta del sRNA Sito di destinazione Due primer sono stati progettati con parziale omologia ad una cassetta sRNA esistente. Il primer forward contiene 20 bp omologa al promotore pR all&#39;estremità 5 &#39;, seguito da24 bp rappresenta la nuova sequenza GUIDE, quindi 18 bp omologa al dominio Hfq vincolante all&#39;estremità 3 &#39;. Il primer inverso è l&#39;esatto complemento inverso del primer in avanti, con le regioni di omologia alla cassetta sRNA esistente che fiancheggia il complemento inverso della nuova sequenza GUIDA. Sequenze di primer esatti sono riportati nella tabella 3. Singolo-primer reazioni PCR separate con l&#39;attaccante e il primer inverso producono lineare, il DNA a singolo filamento con la sequenza modificata desiderato. Ricottura del avanti e indietro prodotti di reazione, dopo clean-up come descritto nel protocollo, si traduce in DNA a doppia elica plasmide che porta la cassetta sRNA modificato desiderato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig3.jpg" /> Figura 3: Knockdown di un reporter cromosomicamente integrato mKate2 fluorescente. E. coli K12 MG1655 esprimere mKate2 erano o non trattata (linee rosse e bar), infettato da un fagemidi anti-mKate2 (linee verdi e bar), o infettato da un controllo phagemid mira CAT (linee blu e bar). (A) greggia E. coli cresciuto a densità di saturazione superiori, indicando un costo metabolico all&#39;infezione fago. Le linee tratteggiate indicano le deviazioni standard di 3 repliche. (B) Il segnale mKate2 stata ridotta a livelli di fondo vicino alla anti-mKate2 trattati ceppo, ma non in ceppi di controllo. Fluorescenza (C) GFP, portato anche dal fagemide, era rilevabile solo nei controlli fagemide trattati. (D, E) letture di fluorescenza finale dopo 24 ore di crescita sono stati normalizzati a OD. il segnale GFP, che indica l&#39;infezione fagemidi, era assente in controlli non trattati, ma anche sostanzialmente ridotto a seguito anti-CAT ptrattamento hagemid. Ciò può indicare effetti off-target del fagemide. Il segnale mKate2 è stato ridotto di un trattamento anti-fagemidi mKate2 rispetto ai controlli non trattati. Il fagemidi controllo CAT-mirato ha mostrato alcun effetto sulla mKate2 fluorescenza. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di 3 repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53618/53618fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown di CAT ripristina la sensibilità cloramfenicolo ad una popolazione geneticamente resistenti E.. coli K12 MG1655 che esprime un gene CAT cromosomicamente integrato sono stati lasciati non trattati (barre rosse), trattati con un fagemide di controllo mira mKate2 (barre verdi), o trattato con un fagemide esprimere un anti-CAT Srna (barre blu). Dopo 1 ora di infezione, viabilità sulla formica indicatoibiotics è stata valutata mediante diluizioni seriali e placcatura. I ceppi trattati con anti-CAT fagemide erano significativamente uccisi (&gt; 90%) di cloramfenicolo a concentrazioni più elevate, mentre i trattamenti di controllo non sono stati influenzati. L&#39;aggiunta di ampicillina alle piastre di coltura seleziona positivamente per l&#39;infezione fagemide ed elimina le cellule non infette. In queste condizioni, non sono state osservate colonie resistenti cloramfenicolo dopo il trattamento anti-CAT. Ciò indica che la maggior parte dei sopravvissuti rappresentano un fallimento di infezione, piuttosto che un fallimento di silenziamento. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 3 repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53618/53618fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> CAT sequenza bersaglio </td><td> 5 &#39;- ATGGAGAAAAAAATCACTGGATAT - 3&#39; </td></tr><tr><td> Sequenza GUIDA CAT </td><td> 5 &#39;- ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Una sequenza esempio TARGET e guida per il CAT Gene Si noti la relazione complemento inverso. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pR promotore </td><td colspan="5"> TAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGC </td></tr><tr><td> sequenza GUIDA </td><td colspan="5"> ATATCCAGTGATTTTTTTCTCCAT </td></tr><tr><td> Hfq dominio di legame </td><td colspan="5"> TTTCTGTTGGGCCATTGCATTGCCACTGATTTTCCAACATATAAAAAGACAAGCCCGAACAGTCGTCCGGGCTTTTTT TCTCGAG </td></tr><tr><td> T1 / TE terminatore </td><td colspan="5"> CTCGAGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTTTTGTCGGTGAA CGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATA </td></tr></tbody></table>Tabella 2:. Componenti sequenza del sRNA cassetta Ogni sequenza è scritto 5&#39;-3 &#39;. La cassetta completa è la concatenazione di questi 4 elementi in ordine e comprende 292 bp. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> forward Primer </td><td> 5 &#39;- CTGGCGGTGATAATGGTTGC [GUIDA] TTTCTGTTGGGCCATTGC - 3&#39; </td></tr><tr><td> Primer Reverse </td><td> 5 &#39;- GCAATGGCCCAACAGAAA [TARGET] GCAACCATTATCACCGCCAG - 3&#39; </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Primer design nei Alter elementi di guida esistenti Il primer in avanti include l&#39;ultimo 20 bp del promotore pr, la nuova sequenza GUIDE, e il primo 18 bp del dominio Hfq vincolante.. La sequenza bersaglio è l&#39;esatto complemento inverso della sequenza GUIDE. Il primer inverso è l&#39;esatto complemento inverso del primer in avanti. </p&gt; <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> plasmide template </td><td> 500 ng </td></tr><tr><td> 10 micron Primer </td><td> 2,5 ml </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td> Ad alta fedeltà della polimerasi (2 U / ml) </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 5x PCR Buffer </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 4: consigliati Condizioni per il Single-Primer mutageni PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> denaturazione iniziale </td><td> 98 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cicli </td><td> 98 ° C </td><td> 10 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 120 sec </td></tr><tr><td> estensione finale </td><td> 72 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Conservazione </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 5: consigliato termociclatore protocollo per il Single-Primer mutageni PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> DNA template </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 10 micron Forward Primer </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 10 micron Reverse Primer </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Taq 2X Master Mix </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> tardo priva di nucleasiR </td><td> 23 ml </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 6: Condizioni suggerita per la sequenza di verifica PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp </td><td> Tempo </td></tr><tr><td> denaturazione iniziale </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td rowspan="3"> 30 cicli </td><td> 95 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 55 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> 68 ° C </td><td> 30 sec </td></tr><tr><td> estensione finale </td><td> 68 ° C </td><td> 300 sec </td></tr><tr><td> Conservazione </td><td> 10 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 7: consigliato Termociclatore Proprotocollo per la sequenza di verifica PCR.

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Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l&#39;espressione genica in<em&gt; E. coli</em

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be ...

phage-mediated-delivery-targeted-srna-constructs-to-knock-down-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

12.5K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris Descartes. We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Video: Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Ricerca

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissezione laser applicata a profili di espressione genica di sottogruppo di cellule dal Drosophila Ala Disco

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

High Throughput Screening espressione quantitativa e purificazione Applicata al ricombinante Disulfide ricchi di Venom proteine ​​prodotte in<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Fago-mediata consegna di mirata sRNA Costruisce per abbattere l'espressione genica in

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