We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Nota: Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in base alle direttive del comitato etico degli animali istituzionale, in conformità con il Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali come amministrato dal Comitato Animal Care di Université Laval. APP-PS1 topi maschi tra i 4 ei 21 mesi di età sono stati utilizzati. Questi animali sono stati alloggiati in un ciclo luce-buio 12 ore a 22 - 25 ° C, con libero accesso a cibo e acqua. 1. Metossi-X04 Solution Preparazione <ol><li> Preparare a 5 mg / ml soluzione di metossi-X04 9 sciogliendo metossi-X04 in una soluzione contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO), 45% di glicole propilenico, e il 45% di fosfato di sodio salina tamponata (0,9% NaCl in 100 mM tampone fosfato , pH 7.4). <ol><li> Utilizzando una microbilancia, pesare 5 mg del composto metossi-X04. Sotto una cappa aspirante, sciogliere il metossi-X04 in DMSO e mescolare fino ad ottenere una soluzione verde chiaro. Successivamente aggiungere glicole propilenico e phosphate tampone salina mescolando con ogni aggiunta. </li><li> Agitare la soluzione a 4 ° C su un rotatore O / N. Ottenere una emulsione verde giallastro. La soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due mesi senza degrado. </li></ol></li></ol> 2. Metossi-X04 soluzione per l&#39;iniezione <ol><li> 24 ore prima della perfusione, pesare i topi e dare ogni topo un&#39;iniezione intraperitoneale di metossi-X04 alla dose di 10 mg / kg di peso corporeo usando un ago 27 G ½. </li></ol> 3. transcardial perfusione del topi iniettati <ol><li> Il giorno prima della perfusione, preparare volumi adeguati di tampone fosfato salino (PBS), 3,5% acroleina, e le soluzioni di 13 4% paraformaldeide (PFA) e conservarli a 4 ° CO / N. Nota: Queste soluzioni saranno utilizzate sia per la perfusione e pre-embedding immunoistochimica. Prestare particolare attenzione quando si lavora con acroleina, in quanto è corrosivo e tossico per entrambiricercatori e l&#39;ambiente. Inoltre, poiché acroleina è corrosivo per plastica, utilizzare sempre vetreria adatto per preparare le soluzioni acroleina. </li><li> Il giorno della perfusione, filtrata del PFA e acroleina utilizzando carta da filtro grossolana di ritenzione delle particelle 25 micron. </li><li> Durante la perfusione, utilizzare una pompa peristaltica per fornire 15 ml di PBS, 75 ml di acroleina, e 150 ml di PFA successivamente nella circolazione mouse, ad un flusso di 25 ml / min. Fai attenzione. Eseguire perfusione rigorosamente all&#39;interno di una cappa aspirante per evitare i fumi nocivi di PFA e acroleina. <ol><li> Per impostare la pompa, inserire un&#39;estremità nella soluzione PBS, riempire il tubo (tenendo circa 15 ml) con PBS, e fissare un 25 G alato raccolta del sangue ago per l&#39;altra estremità. In ogni momento, in modo che il tubo è esente da bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> Posizionare il tubo direttamente nella bottiglia acroleina dopo aver impostato la pompa di perfusione con il tubo riempito con PBS. </li></ol></li><li> Unaesthetize un mouse alla volta con 90 mg / kg di peso corporeo dosi di pentobarbital sodico iniettati per via intraperitoneale con una ½ ago 27 G. Valutare le risposte a pizzichi coda / tep. Procedere solo se il mouse non risponde a tali avverse, stimoli dolorosi. </li><li> Fissare il mouse in posizione supina (sdraiato sulla schiena con la faccia verso l&#39;alto) con nastro adesivo le zampe anteriori e hindpaws al piano di lavoro ed esporre con cura il cuore senza causare danni ad altri organi. Essere sicuri di lavorare subito dopo la puntura del diaframma. <ol><li> Eseguire un&#39;incisione attraverso la pelle con le forbici chirurgiche lungo la linea mediana del torace cominciando caudale alla cassa toracica e procedere rostrale alla clavicola. </li><li> Fare due incisioni laterali supplementari lungo la base della gabbia toracica ventrale. Delicatamente spostare e pin i due lembi di pelle, avendo cura di esporre tutta la cavità toracica. </li><li> Tenere il processo xifoideo con una pinza smussato per esporre la cavità toracica e stabilizzare la forbice a puntaS. Tagliare attraverso il diaframma e la gabbia toracica, facendo attenzione a evitare la puntura i polmoni, e continuare il rostrale incisione per le clavicole. Essere sicuri di lavorare subito dopo la puntura del diaframma. </li></ol></li><li> strappare delicatamente il sacco pericardico con una pinza smussato. Tenere il cuore stabile con una pinza smussato, tagliare l&#39;atrio destro e iniziare l&#39;infusione di PBS. Inserire immediatamente l&#39;ago di raccolta del sangue nel ventricolo sinistro. </li><li> Profumato il mouse con PBS (nel tubo) seguita da acroleina per 3 min (corrispondente a 75 ml) quindi passare alla PFA per 6 minuti (corrispondenti a 150 ml). Assicurarsi di mettere in pausa la portata della pompa prima di passare soluzione per evitare le bolle di penetrare nel tubo. </li><li> Decapitare il mouse ed estrarre il cervello fisso e inserirlo direttamente in una fiala di vetro contenente 4% PFA per almeno 2 ore a 4 ° C. <ol><li> Per estrarre il cervello, usare le forbici e pinzette per tagliare attraverso la pelle per esporre il cranio. rompere con cautela il op cranioit in mezzo agli occhi, e chip off piccoli pezzi di esso per esporre il cervello sottostante. </li><li> Rimuovere con attenzione il cervello e post correzione esposto con 4% PFA per un ulteriore 2 ore prima di procedere per vibratome sezionamento. </li></ol></li></ol> 4. Cervello sezionamento Utilizzando un Vibratome <ol><li> Lavare il cervello fisso 3 volte con PBS freddo. Utilizzando una lama di rasoio affilata, rimuovere il bulbo olfattivo (a meno che questa regione è indagato) e tagliare il cervello trasversalmente in 2 - 3 pezzi di approssimativamente uguale altezza, ognuno dei quali può essere sezionati simultaneamente per accelerare la procedura. </li><li> Incollare i pezzi di tessuto cerebrale verticalmente sul piatto portacampione fissata nel vassoio. Assicurarsi che la superficie di taglio liscia attacca saldamente alla piastra campione e non viene spostato durante la procedura di sezionamento. Aggiungere sufficiente soluzione di PBS nel cassetto fino a quando l&#39;intera superficie del cervello è completamente sommerso. È importante mantenere thpezzi di cervello e e le sezioni successive completamente immersi in PBS in tutta questa fase. </li><li> Posizionare il vassoio nel vibratome, regolare la velocità di taglio di 0,5 mm / sec, la frequenza di taglio di 90 Hz, e lo spessore di alimentazione a 50 micron per produrre 50 sezioni micron di spessore. Poi il trasferimento delle sezioni in fiale di vetro da 20 ml contenenti soluzione crioprotettore (40% PBS, 30% glicole etilenico, e il 30% glicerolo) utilizzando un pennello fine. Conservare le fiale a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. In alternativa, mantenere le sezioni in PBS per lo screening immediato come descritto nella procedura seguente. </li></ol> 5. Sezione Screening per la presenza di placche metossi-X04-macchiati <ol><li> Con l&#39;aiuto di un cervello stereotassico topo atlas 14, selezionare sezioni di cervello contenenti la regione di interesse, per esempio, il CA1 dell&#39;ippocampo come utilizzato nel presente esempio. Mettere ogni sezione in un pozzo all&#39;interno di una piastra di coltura da 24 pozzetti contenente soluzione crioprotettore abbastanzain modo da impedire sezioni si secchi. </li><li> Esaminate ogni sezione in successione, per evitare l&#39;essiccazione sezioni, utilizzando la seguente procedura: <ol><li> Aggiungere una goccia di PBS ad un vetrino da microscopio con una pipetta monouso e posizionare la sezione sul droplet. </li><li> Esaminare la sezione al microscopio a fluorescenza per identificare le regioni contenenti placche Ap metossi-X04 etichettati. Nota: metossi-X04 può essere facilmente visualizzato utilizzando un filtro a fluorescenza ultravioletta (UV) (eccitazione 340 - 380 nm). </li></ol></li><li> Catturare immagini di regioni di interesse (ROI) in campo chiaro e in modalità di fluorescenza senza spostare la fase di microscopio, poiché ogni immagine deve mostrare la stessa regione in entrambi i campi per correlare la presenza delle placche direttamente alla regione strutturale la sezione di tessuto. </li><li> Salvare e denominare le immagini scattate in base al numero degli animali. Registrare inoltre il numero di pozzetto nella piastra e il campo delle immagini taken. Ad esempio, Es: 9978A1B; il numero di animali: 9978; Bene numero: A1; Campo: luminoso. Posizionare la sezione posteriore nel suo designato bene una volta di imaging è stata completata. Nota: Alla fine, per ciascuna sezione esaminato, due immagini sono ottenute, uno in campo chiaro e un altro nel campo UV. </li><li> Aprire le due immagini della stessa ROI (uno in campo chiaro e l&#39;altro nel campo UV) in figura J, e utilizzando il plugin MosaicJ, allineare i bordi delle due immagini e salvare l&#39;immagine allineata e combinato secondo il numero bene venire da. </li><li> Salvare l&#39;immagine in una cartella separata con il numero del particolare animale. Combinare le immagini per identificare e localizzare le placche nella sezione di tessuto, e hanno una vista completa dell&#39;intera sezione i due campi diversi (luminose e UV). </li><li> Dopo il processo di screening è completato, memorizzare sezioni esaminate a -20 ° C in una piastra di coltura a 24 pozzetti contenenti crioprotettore fino immunocolorazione o alla trasformazione è caRRied fuori. </li></ol> 6. Pre-embedding Immunocolorazione per Iba1 Nota: Eseguire la immunocolorazione per Iba1 su sezioni liberamente fluttuanti selezionati posizionando la piastra su una sedia a dondolo che si muovono lentamente a temperatura ambiente. <ol><li> Lavare accuratamente le sezioni 3 volte con circa 1 ml di PBS, ogni lavaggio della durata di 10 min. </li><li> Quench perossidasi endogena con perossido di idrogeno 0,3% in soluzione PBS per 10 min. Questo passaggio impedisce perossidasi non specifico, che è importante per evitare colorazione di fondo. </li><li> Lavare il tessuto in PBS 3 volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Incubare le sezioni in boroidruro di sodio allo 0,1% in soluzione PBS per 30 min. Questo passo è importante per ridurre eventuali rimanenti aldeidi dalla fase di fissaggio, ed è particolarmente importante se acroleina è utilizzato in fissaggio del tessuto. </li><li> Lavare il tessuto in PBS 3 volte per 10 minuti ogni volta e assicurarsi di rimuovere tutte le bolle. </li><li> Bloccare le sezioni per 1 ora.Diversi anticorpi possono richiedere diversi tempi e le soluzioni di blocco. Per Iba1, preparare un tampone di bloccaggio contenente 10% di siero fetale bovino, 3% di albumina sierica bovina, e 0,01% Triton X-100 in 50 mM di soluzione salina tamponata con Tris (TBS; pH 7,4). Nota: Il passo di blocco è quello di prevenire il legame non specifico dell&#39;anticorpo primario. La bassa concentrazione di Triton X-100 permette leggera permeabilizzazione delle membrane per una migliore colorazione, ed è abbastanza basso per preservare maggior parte delle caratteristiche ultrastrutturali del tessuto sotto EM. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante dal tessuto e incubare in soluzione di anticorpo primario (coniglio anti-Iba1, diluito [1: 1000] in tampone bloccante) a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare in TBS 3 volte per 10 minuti ogni volta. </li><li> Incubare in anticorpo secondario (goat anti-rabbit coniugata con biotina) [1: 200] in 0,05 M TBS per 90 min. </li><li> Lavare in TBS 5 volte per 5 minuti ogni volta. </li><li> Incubare in soluzione del complesso avidina-biotina (avidina [1: 100], biotina [1: 100]) in TBSsoluzione per 1 ora. </li><li> Lavare in TBS 5 volte per 5 minuti ogni volta. </li><li> Rivela la colorazione Iba1 con 0,05% diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 0,015% in TBS per 8 min. Nota: I tempi di sviluppo DAB può variare da protocollo per il protocollo e deve essere determinata esaminando velocemente le sezioni colorate al microscopio ottico. Nota: Per Iba1, si dovrebbe essere in grado di visualizzare chiaramente i corpi cellulari e dei processi delle microglia Iba1 macchiati a 20X (vedi figura 2 per esempio rappresentativo). Essere cauti con DAB, in quanto è un noto cancerogeno. </li><li> Evitare over-sviluppo controllando attentamente le sezioni (come descritto sopra) in questa fase. Arrestare la reazione lavando sezioni in PB refrigerata 5 volte per 5 minuti ogni volta. </li></ol> 7. elaborazione per la microscopia elettronica <ol><li> Preparare 1% soluzione di osmio tetrossido in PBS in una fiala di vetro. Tetrossido di osmio è fotosensibile; coprire la gfiala lass con un foglio di alluminio per proteggere la soluzione dalla luce. Sia prudente con tetrossido di osmio, in quanto è una sostanza chimica molto pericolosa. Eseguire questa e le seguenti operazioni all&#39;interno di una cappa aspirante. </li><li> Rimuovere la PBS dalle sezioni e diffonderli piatta usando un pennello fine. Eseguire questo passo si bene alla volta per mantenere sezioni si secchi. Assicurarsi di appiattire le sezioni immediatamente prima di aggiungere tetrossido di osmio, come eventuali pieghe nelle sezioni diventeranno permanenti e il tentativo di appiattire il tessuto messaggio osmio fissazione romperà solo sezioni. </li><li> Immergere le sezioni in tetrossido di osmio per 30 minuti a RT, aggiungendo una goccia di tetrossido di osmio per volta con una pipetta di trasferimento, per evitare che le sezioni di piegatura. Coprire il bene con un foglio di alluminio per proteggere le sezioni dalla luce. Nota: Questo passaggio consente di risolvere i lipidi all&#39;interno delle sezioni. Il tessuto apparirà molto scuro dopo osmio post-fissazione. </li><li> Mentre le sezioni sono in osmio TetroXide, preparare resina plastica in un bicchiere usa e getta mescolando 20 g componente A, 20 g di componente B, 0,6 g componente C, e 0,4 g componente D. Unire i componenti insieme nell&#39;ordine sopra e mescolare bene con un 10 ml pipetta sierologica fino ad ottenere un colore uniforme. </li><li> Trasferire la miscela preparata ai piatti del peso di alluminio. Essi riceveranno le sezioni di tessuto, una volta che sono stati disidratati. </li><li> Disidratare sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo per 2 minuti nel seguente ordine: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%. </li><li> Per rimuovere l&#39;etanolo residuo, immergere le sezioni in ossido di propilene 3 volte per 2 minuti ogni volta. Rimuovere le disidratati sezioni dalla piastra di coltura da 24 pozzetti in 20 ml fiale di vetro. Utilizzare sempre fiale di vetro quando si lavora con ossido di propilene come si scioglie in plastica, e mantenere la cautela, in quanto è pericolosa. </li><li> Utilizzare una punta di vetro curvato pipetta o un pennello fine di trasferire le sezioni da soluti ossido di propilenesulla nella resina e lasciare O / N per l&#39;infiltrazione a RT. Fare attenzione a non diluire la resina con ossido di propilene. </li><li> Incorporare la sezione con la resina di poli-cloro-tri-fluoro-etilene (PCTFE) filmsheets: <ol><li> Porre le capsule del peso di alluminio contenenti i campioni in un 50 - 60 ° C forno per 10 - 15 minuti prima di incorporare le sezioni filmsheets PCTFE. </li><li> Quando l&#39;incorporamento sezioni, lavorare con uno in alluminio del peso di piatto alla volta. Utilizzando un pennello fine, dipingere un sottile strato di resina su un foglio di pellicola PCTFE. </li><li> Spostare una sezione di tessuto alla volta dal alluminio di peso piatto per il foglio di pellicola PCTFE. Rimuovere la resina in eccesso provenienti da tutto il tessuto, facendo attenzione a non disturbarlo. </li><li> Dopo aver spostato tutte le sezioni da un peso piatto per il foglio di pellicola PCTFE, posizionare un secondo foglio PCTFE sopra il primo, creando un sandwich di tessuto e resina tra 2 fogli. </li></ol></li><li> Polimerizzare la resina in un incubatore per 3 giorni a 55-60 ° C. </li><li> Il materiale è ora pronto per ultrasottile sezionamento ed esame ultrastrutturale, tecniche specializzate che sono spesso eseguite da strutture principali EM. Conservare i campioni tra fogli di pellicola PCTFE tranquillamente a RT senza degradazione ultrastrutturali. Nota: I passi successivi per ultrasottili sezionamento e la trasmissione esame al microscopio elettronico sono spiegate in un protocollo separato 13. </li></ol>

<ol>
	<li>Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).</li><li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis.">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li><li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+attack:+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease.">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li><li>Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04,+a+systemically+administered+Congo+red+derivative.">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li><li>Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peephole+into+the+brain:+Neuropathological+features+of+Alzheimer's+disease+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging.">A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Front Psychiatry. 3, 26 (2012).</li><li>Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Cx3cr1+knockout+prevents+neuron+loss+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).</li><li>Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+amyloid+deposition+in+the+brains+of+transgenic+mice+coexpressing+mutant+presenilin+1+and+amyloid+precursor+proteins.">Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins.</a> Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).</li><li>Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuritic+plaques+in+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li><li>Bussi&#232;re, T., Bard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+Thioflavin-S-positive+amyloid+plaques+in+transgenic+Alzheimer+mice+and+effect+of+passive+Abeta+immunotherapy+on+their+clearance.">Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance.</a> Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).</li><li>Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+of+amyloid+and+pre-amyloid+peptides+and+proteins+in+mouse+tissue.">Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue.</a> Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).</li><li>Afkhami, A., Moosavi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorptive+removal+of+Congo+red,+a+carcinogenic+textile+dye,+from+aqueous+solutions+by+maghemite+nanoparticles.">Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles.</a> J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).</li><li>Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+brain+tissue+for+immunoelectron+microscopy.">Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Konsman, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+priming+and+enhanced+reactivity+to+secondary+insult+in+aging,+and+traumatic+CNS+injury,+and+neurodegenerative+disease.">Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease.</a> Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).</li><li>Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>&#352;i&#353;kov&#225;, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+synapse:+Interactions+in+health+and+neurodegeneration.">Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration.</a> Neural Plast. 2013, 425845 (2013).</li><li>DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+correlates+of+cognition+in+dementia:+quantification+and+assessment+of+synapse+change.">Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change.</a> Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).</li><li>Terry, R. D., Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+cognitive+alterations+in+Alzheimer's+disease:+Synapse+loss+is+the+major+correlate+of+cognitive+impairment.">Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment.</a> Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo spiega un approccio correlativo per il targeting denso nucleo placche Ap con EM. Metossi-X04 a iniezione vivo permette una rapida selezione di sezioni del cervello che contengono placche Ap all&#39;interno di particolari regioni e strati di interesse, ad esempio, il CA1 dell&#39;ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Nel presente esempio, metossi-X04 pre-screening è stato combinato con pre-embedding immunocolorazione per Iba1 per studiare come i diversi fenotipi microgli...

Amiloide Ap formazione della placca è il principale segno distintivo neuropatologici della malattia di Alzheimer (AD). Tuttavia crescente evidenza suggerisce un ruolo importante del sistema immunitario nella progressione della malattia 1,2. In particolare, i nuovi dati provenienti da studi preclinici e clinici stabiliti disfunzione immunitaria come un driver principale e collaboratore di AD patologia. Con questi risultati, le cellule immunitarie centrali e periferiche sono emersi come bersagli terapeutici promettenti per AD 3. Il seguente protocollo combina luce e microscopia elettronica (EM) per generare nuove intuizioni sulla relazione tra la deposizione di placche Ap e le alterazioni fenotipiche microgliali in AD. Questo protocollo permette l&#39;etichettatura delle placche Ap in modelli murini di AD utilizzando a iniezione vivo del colorante fluorescente metossi-X04. Metossi-X04 è un derivato Rosso Congo che può facilmente attraversare la barriera emato-encefalica per entrare nel parenchima cerebrale e si legano fogli β-pieghe con alto unffinity. Poiché il colorante è fluorescente, può essere utilizzato per il rilevamento in vivo della deposizione della placca Ap con microscopia a due fotoni 4. Una volta legato alla Ap, metossi-X04 non si dissocia o ridistribuire lontano da placche, e mantiene la sua fluorescenza nel tempo. E &#39;generalmente somministrato perifericamente per consentire imaging non invasiva della dinamica cerebrale 5. La fluorescenza rimane anche dopo fissazione aldeide, consentendo analisi correlativa post-mortem, inclusa la verifica di morte neuronale in prossimità delle placche Ap 6. Questo protocollo sfrutta le proprietà di metossi-X04 per selezionare le sezioni del cervello di topi APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpressing una doppia mutazione in APP gene Lys670Asn / Met671Leu, e la variante presenilina PS1-A264E umano) 7 che esibiscono A? placche in determinate regioni di interesse (ippocampo CA1, radiatum strati, e lacunosum-moleculare) Prima di pre-embedding immunocolorazione contro il marcatore microglial ionizzato legante il calcio adattatore molecola 1 (Iba1) per visualizzare i corpi cellulari microgliali e processi con EM. I topi sono dati iniezione intraperitoneale di soluzione metossi-X04, 24 ore prima della fissazione cervello attraverso perfusione transcardial. sezioni di cervello coronali sono ottenuti utilizzando un vibratome. Sezioni contenenti il ​​CA1 dell&#39;ippocampo sono proiettati sotto un microscopio a fluorescenza per la presenza di placche Ap in radiatum strati e lacunosum-moleculare. Immunocolorazione per Iba1, tetrossido di osmio post-fissazione, e resina plastica incorporamento vengono poi eseguite su sezioni di cervello selezionati. Alla fine di questo protocollo, le sezioni possono essere archiviati senza ulteriore degrado ultrastrutturali, pronto per ultrasottili sezionamento e l&#39;esame ultrastrutturale. È importante sottolineare che le placche sono ancora fluorescenti dopo immunostaining con anticorpi diversi, per esempio Iba1 come nel presente protocollo. Essi diventano più scure than loro neuropil circostante seguente tetrossido di osmio post-fissazione, indipendentemente metossi-X04 colorazione, che aiuta a identificare accuratamente le regioni di interesse, generalmente fino a pochi millimetri quadrati, da esaminare con il microscopio elettronico a trasmissione. Questo approccio correlativo offre un modo efficace per identificare le sezioni specifiche del cervello per esaminare a livello ultrastrutturale. Ciò è particolarmente utile quando si studia la patologia AD precoce, all&#39;interno delle regioni specifiche del cervello o strati che possono contenere solo poche placche Ap, presenti solo in una piccola frazione di sezioni di tessuto. Durante questi periodi particolare, sarebbe inefficiente per usare immunostaining per Ap (e doppia etichettatura per altri marcatori cellulari quali Iba1) in diverse sezioni di cervello semplicemente per fornire una piccola frazione contenente placche Ap nella posizione giusta. Inoltre, l&#39;iniezione di topi dal vivo con metossi-X04 prima del sacrificio e la lavorazione dei tessuti non lo fa compromisvia e la conservazione ultrastrutturali. Metodi alternativi come il post mortem colorazione con Rosso Congo, Thioflavin S, T o Thioflavin metossi-X04 su sezioni di tessuto fissate richiedono differenziazione colorazione in etanolo, 8-11 che causa stress osmotico e disturba l&#39;ultrastruttura. Congo Rosso è anche un noto cancerogeno per l&#39;uomo 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Un protocollo dettagliato è fornito qui per identificare amiloidi Ap placche nelle sezioni del cervello di modelli murini della malattia di Alzheimer prima pre-embedding immunostaining (in particolare per ionizzato adattatore molecola legante il calcio 1 (Iba1), un calcio proteina legante espressa da microglia) e la lavorazione dei tessuti per microscopia elettronica (EM). Metossi-X04 è un colorante fluorescente che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega ai fogli beta a pieghe si trovano in fitto nucleo placche Ap selettivamente. Iniezione degli animali con metossi-X04 prima del sacrificio e la fissazione del cervello consente di pre-screening e selezione delle sezioni di cervello placca contenenti per l&#39;ulteriore elaborazione con manipolazioni in termini di tempo. Ciò è particolarmente utile quando si studia la patologia AD presto all&#39;interno delle regioni specifiche del cervello o strati che possono contenere pochissime targhe, presenti in solo una piccola frazione delle sezioni. trattamento post-mortem di sezioni di tessuto con Rosso Congo, Thioflavin S, e ThioflAvin T (o anche con metossi-X04) possono etichettare fogli beta-pieghe, ma richiede una compensazione con etanolo per rimuovere colorante in eccesso e queste procedure sono incompatibili con la conservazione ultrastrutturali. Sarebbe anche inefficiente per realizzare un&#39;etichettatura per Ap (e altri marcatori cellulari quali Iba1) su tutte le sezioni di cervello dalle regioni di interesse, solo per produrre una piccola frazione contenente placche Ap nella posizione giusta. È importante sottolineare che, placche Ap sono ancora visibili dopo la lavorazione dei tessuti per EM, permettendo una precisa identificazione delle aree (in genere fino a pochi millimetri quadrati) esaminare con il microscopio elettronico.

Questa sezione illustra i risultati ottenibili in diverse fasi critiche del protocollo. In particolare, i risultati mostrano esempi di sezioni del cervello che contengono metossi-X04 placche macchiati della regione specifica e strati di interesse: il CA1 dell&#39;ippocampo, radiatum strati, e lacunosum-moleculare. Le placche e l&#39;organizzazione regionale / lamellare dell&#39;ippocampo sono successivamente visualizzati utilizzando una combinazione di filtri UV e in campo chiaro <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃŽÂ²-Amyloid Plaques at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di amiloide Ap placche in modelli murini della malattia di Alzheimer con metossi-X04, che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega alla beta-pieghe fogli trovati nella fitta principali placche Ap selettivamente. Esso consente di pre-screening delle sezioni di tessuto placca contenenti prima dell&#39;immunocolorazione ed elaborazione per la microscopia elettronica.

Correlativo luce e microscopia elettronica allo Studio microgliali Interazioni con placche beta-amiloide

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  CHU de Québec Research Center.  Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di amiloide Ap placche in modelli murini della malattia di Alzheimer con metossi-X04, che attraversa la barriera emato-encefalica e si lega alla beta-pieghe fogli trovati nella fitta principali placche Ap selettivamente. Esso consente di pre-screening delle sezioni di tessuto placca contenenti prima dell'immunocolorazione ed elaborazione per la microscopia elettronica. 

Video: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Ricerca

Neuroscienze

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsordimento molecolare indotto dalla luce delle proteine utilizzando il sistema PRIMO per micro-patterning per studiare le risposte cellulari alle proteine a matrice extracellulare

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Correlativo luce e microscopia elettronica allo Studio microgliali Interazioni con placche beta-amiloide

PLAYLIST