MG, MO'C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Herv&#233; Cottet (Montpellier) for discussions.

1. Preparazione di chitosano Films <ol><li> Pesare 2 g di acido acetico glaciale, completa a 100 ml con acqua ultrapura. </li><li> Pesare 1,7 g di polvere di chitosano, aggiungere 100 ml di soluzione di acido 2% m / m acetico acquoso. Mescolare per 5 giorni con ancoretta e piatto agitazione magnetica a temperatura ambiente sia coperto con un foglio di alluminio o al buio. </li><li> Centrifugare la dispersione chitosano a 1.076 xg a 23 ° C per 1 ora. Raccogliere il surnatante con una siringa ed eliminare il precipitato. </li><li> Per ogni film, un&#39;aliquota da 10 ml della sospensione chitosano in a 9 cm In plastica Petri a temperatura ambiente. Lasciare i film coperti ad asciugare per almeno 7 giorni. </li><li> forbici Uso tagliare i film secchi in 1 x 1 cm quadrati. Nota: L&#39;esperimento può essere messo in pausa in questa fase. </li></ol> 2. Preparazione di PBS (PBS) <ol><li> Pesare 8 g di cloruro di sodio, cloruro di potassio 0,2 g, 1,44 g di disodio idrogeno fosfatophate e 0,24 g potassio fosfato monobasico. </li><li> Sciogliere questi prodotti chimici pesati in 800 ml di acqua ultrapura e titolare la soluzione con acido cloridrico concentrato fino a pH 7,4. Nota: L&#39;esperimento può essere messo in pausa in questa fase. </li></ol> 3. Preparazione di 75 mM Sodio borato Tampone a pH 9.2 <ol><li> Pesare 3,0915 g di acido borico. Sciogliere in 75 ml di acqua ultrapura. </li><li> Titolare la soluzione di acido borico a pH 9,2 con una soluzione di idrossido di sodio ad una concentrazione di 10 M o superiore. Attenzione: concentrato soluzioni d&#39;idrossido di sodio sono corrosivi e devono essere maneggiati con i guanti. </li><li> Completa di acqua ultrapura per ottenere 100 ml di soluzione. Ciò produce un tampone borato di sodio 500 mM a pH 9.2. </li><li> Diluire il tampone borato di sodio da 500 mm con acqua ultrapura a 75 mm tampone borato di sodio. Nota: L&#39;esperimento può essere messo in pausa in questa fase. </li></ol> 4. Preparazione di Chitosan FiLMS per la reazione di innesto <ol><li> Risciacquare 10 film chitosano quadrati (1 x 1 cm) in 5 ml di PBS per 2 ore in una piastra di Petri a temperatura ambiente. </li><li> Durante questo tempo, preparare e validare lo strumento elettroforesi capillare (fase 5). </li></ol> 5. Preparazione e validazione dello strumento di elettroforesi capillare <ol><li> Preparare un capillare di silice fusa 43,5 cm nudo con un diametro interno di 50 micron (43,5 centimetri è la lunghezza totale, la lunghezza efficace per la finestra di rilevamento è tipicamente 35 cm) indebolendo il rivestimento esterno in polimero del capillare alla lunghezza impostata con un utensile smussato quindi scattare il capillare. <ol><li> Creare una finestra per il capillare usando un accendino per bruciare il rivestimento polimerico a 8,5 cm dal ingresso e dopo si raffredda pulirla con etanolo. Bruciare il rivestimento del capillare a ciascuna estremità per qualche millimetro con un accendino, e dopo si raffredda pulirla con etanolo. </li><li> Luogo capillare insiFinestra di rilevamento e installarlo nel cassetto capillare mettendolo a lunghezze uguali in ingresso e uscita e avvolgerlo attorno ai mandrini della cassetta. Quindi installare la cassetta nello strumento elettroforesi capillare. </li></ol></li><li> Impostare i parametri del metodo per ogni separazione. Nel menu del software selezionare &quot;metodo&quot; e poi &quot;modificare l&#39;intero metodo&quot;. Impostare la temperatura, il tempo, la tensione e fiale utilizzati per la separazione (ad esempio 25 ° C, 10 min, 30 kV). <ol><li> Nella sezione di pre-condizionamento, impostare le vampate consecutive: 10 min con 1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con 0,1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con acqua ultrapura e 5 min con 75 mM di tampone borato di sodio a pH 9.2 per il primo metodo di una serie di analisi. </li><li> Per i metodi successivi, impostare il set le vampate consecutivi nella sezione precondizionamento: 1 min con 1 M di idrossido di sodio (in acqua), 5 min con 75 mM di tampone borato di sodio a pH 9.2. </li><li> Nella sezione di iniezione, parametri impostati per un&#39;iniezione idrodinamico con pressione 30 mbar per 10 sec per tutti i metodi. Nella sezione di separazione, impostare le condizioni di separazione a 30 kV a 25 ° C per 9 minuti per tutti i metodi. NOTA: consultare il manuale di specifici dello strumento CE come procedura per il funzionamento dello strumento CE può variare tra i costruttori. Preparare la soluzione di idrossido di sodio 1 M il giorno. </li></ol></li><li> Iniettare e separare standard interno neutra (10 ml di 10% v / v dimetilsolfossido (DMSO), in acqua diluita in 450 ml di 75 mM tampone borato di sodio). Poi iniettare e separare nello stesso modo uno standard oligoacrylate (disciolto in acqua ultrapura a 10 g ∙ L -1; vedere Elenco dei materiali) per verificare la validità del capillare. Mettere in pausa la sequenza di qui fino a quando la reazione di innesto è pronto per iniziare. </li></ol> 6. Accrescimento di RGDS Onto chitosano Film <ol><li> Pesare il peptide (1 mg RGDS)e gli agenti di accoppiamento (3 mg EDC-HCl e 2 mg NHS). </li><li> 2 ore dopo l&#39;inizio della ammollo pellicola chitosano in PBS, sciogliere il peptide e gli agenti di accoppiamento in 5 ml di PBS. <ol><li> Dai un&#39;aliquota 50 ml di questa soluzione. Aggiungere 2 ml di 10% v / v DMSO in acqua come standard neutro interno per aliquota. Analizzare l&#39;aliquota con CE (vedi punto 7). </li></ol></li><li> Rimuovere i 5 ml di PBS utilizzati per lavare i film chitosano dalla capsula di Petri. Aggiungere la soluzione di agenti peptidici e accoppiamento 5 ml al piatto Petri contenente i film chitosano. </li><li> Coprire la piastra di Petri con la pellicola di paraffina e posizionarlo su un agitatore orbitale a temperatura ambiente. Prendere 50 microlitri aliquote di mezzi di reazione ad orari prestabiliti. NOTA: Il tempo di analisi totale con CE è di 15 minuti, quindi una aliquota può essere assunto ogni 15 min (o ogni 30 min se due reazioni sono monitorati in parallelo, etc.). <ol><li> Aggiungere 2 ml di 10% v / v DMSO in acqua come standard neutro interno ad ogni alIQUOT. NOTA: Aliquote dovrebbero essere analizzati con CE non appena si sono presi (vedi punto 7). </li></ol></li><li> Dopo 4 ore di agitazione e la rimozione aliquote, rimuovere la piastra di Petri da shaker. Rimuovere il mezzo di reazione dalla piastra di Petri. Aggiungere 5 ml di PBS per risciacquare i film chitosano. </li><li> Rimuovere la PBS dalla capsula di Petri, lavare il film chitosano con acqua ultrapura e lasciare asciugare durante la notte. Rimuovere l&#39;acqua ultrapura e memorizzare i film a -20 ° C in una plastica Petri. </li></ol> 7. Monitoraggio di innesto di reazione Usando CE <ol><li> Iniettare e aliquote separate di mezzi di reazione subito dopo la rimozione dalla piastra di Petri con le condizioni di analisi, come nella sezione 5.2. </li><li> Al termine delle separazioni risciacquare il capillare con acqua ultrapura per 10 min. Essiccare attraverso un filo con un flacone vuoto (aria) per 10 min. NOTA: L&#39;esperimento può essere messo in pausa in questa fase. </li></ol> 8. Trea dati<html> tment per CE <ol><li> Controllare la validità di ogni separazione, verificando che sia la corrente durante la separazione e il tempo di migrazione del marcatore mobilità elettroosmotico (DMSO in questo caso) sono simili a quelli osservati per la separazione standard di oligoacrylate. NOTA: fino al 10-15% variazione è accettabile dal valore attuale atteso di circa 50 μA e valore temporale migrazione di 1.3 min (valori mobilità elettroforetica dovrebbero essere utilizzati al posto dei tempi di migrazione, se è richiesta una ripetibilità superiore). </li><li> Per ogni separazione di successo, esportare i dati grezzi dal software elettroforesi capillare selezionando un insieme di dati specifici, a destra cliccando su esportazioni e selezionando un segnale appropriato. </li><li> Convertire i dati grezzi registrati dal CE (presentata come assorbanza UV in funzione del tempo di migrazione). Convertire l&#39;asse X (migrazione tempo t m) in un μ mobilità elettroforetica seguente Equazione 1: n 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg &quot;/&gt; (1) dove L d è la lunghezza al rivelatore, L t è la lunghezza totale del capillare, V è la tensione, e t eo è il tempo di migrazione di una specie neutra (standard interno DMSO in questo caso) 27. Convertire l&#39;asse Y dei dati grezzi (assorbanza in au) per una distribuzione di mobilità elettroforetica W (μ) seguente Equazione 2: 28 <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54549/54549eq2.jpg" /> (2) </li></ol> 9. Altre caratterizzazione di film Peptide-innestato 18 <ol><li> Inserire film chitosano peptide-innestate, laminati intorno a sé, in uno stato solido NMR rotore 4 mm. Riempire il rotore con PBS a ingrossare le pellicole, e chiudere il rotore. Attendere un paio d&#39;ore. </li><li> Analizzare il film con 13 &lt;/ sup&gt; C spettroscopia NMR 18. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La semplicità del protocollo qui descritto rende ideale per applicazione diffusa. Tuttavia, particolare attenzione deve essere prestata ai seguenti passaggi chiave. Preparazione strumento adeguato CE È importante separare uno standard noto immediatamente prima della separazione di campioni sconosciuti (così come al termine di una serie di separazioni) per verificare la validità del capillare e strumento il giorno. Questo standard può essere ...

Soluzione libero elettroforesi capillare (CE) è una tecnica che separa composti in soluzioni basate sulla loro carica-attrito rapporto di 1,2. Rapporto Charge-to-size è spesso menzionato nella letteratura, ma questa semplificazione non si applica a polielettroliti, tra cui polipeptidi in questo lavoro, ed è stato anche dimostrato di non essere adatto per piccole molecole organiche 3. CE differisce da altre tecniche di separazione in quanto non hanno una fase stazionaria, solo uno sfondo elettrolita (di solito un buffer). Questo permette la tecnica per essere resistente nella sua capacità di analizzare una vasta gamma di campioni con matrici complesse 4 come fibre vegetali 5, infusi fermentazione 6 innesto su polimeri sintetici 7, campioni alimentari 8, e peptidi difficilmente solubili 9 senza preparazione del campione noioso e purificazione. Ciò è particolarmente significativo per polielettroliti complessi che hanno problemi di dissoluzione (iuch come chitosano 10 e gellano 11) e quindi esiste come aggregato o precipitato in soluzione e sono stati analizzati con successo senza filtrazione campione. Inoltre, l&#39;analisi degli zuccheri in cereali per la colazione coinvolto l&#39;iniezione di campioni con particelle di campioni di cereali per la colazione precipitato in acqua 8. Questo si estende anche all&#39;analisi dei polielettroliti o copolimeri 12,13 ramificati. Un&#39;ampia attività è stata completata nello sviluppo di tecniche CE specificamente per l&#39;analisi di proteine per proteomica 14, separazione chirale di peptidi naturali o sintetici 15 e separazioni microchip di proteine e peptidi 16. Poiché la separazione e l&#39;analisi avvengono in un capillare, solo piccoli volumi di campione e vengono utilizzati solventi che permette CE di avere un costo di esercizio inferiore rispetto ad altre tecniche di separazione compresa cromatografia 5,6,17. Poiché la separazione da CE è veloce, permette il monitoAnello di cinetica di reazione. Questo è stato dimostrato nel caso di innesto di peptidi su film chitosano per una migliore adesione cellulare 18. Il chitosano è un polisaccaride derivato dal -deacetylation N di chitina. Film chitosano possono essere utilizzati per diverse applicazioni biomediche come bioadesivi 19 e substrati di crescita cellulare 18,20, a causa della biocompatibilità del chitosano 21. Attaccamento cellulare di specifiche proteine della matrice extracellulare, come fibronectina, collagene e laminina, è direttamente legata alla sopravvivenza delle cellule 22. In particolare, differenti tipi cellulari richiedono spesso attaccamento alle diverse proteine ​​della matrice extracellulare per la sopravvivenza e il corretto funzionamento. Adesione cellulare ai film di chitosano ha dimostrato di essere migliorata attraverso l&#39;innesto di fibronectina 23; tuttavia, la preparazione, la purificazione e l&#39;innesto di tali proteine ​​di grandi dimensioni non è economicamente sostenibile. In alternativa una serie di piccoli peptidi have stato dimostrato di essere in grado di imitare le proprietà di grandi proteine ​​della matrice extracellulare. Ad esempio, i peptidi come i RGD mimetici fibronectina (arginina - glicina - acido aspartico) e RGDS (arginina - glicina - acido aspartico - serina) sono stati utilizzati per facilitare e rafforzare il legame delle cellule 24. Covalent innesto di RGDS Onto film chitosano ha migliorato l&#39;adesione delle cellule per cellule conosciute da allegare alla fibronectina in vivo 18. Sostituendo le proteine ​​più grandi piace fibronectina con peptidi più piccoli che hanno la stessa funzionalità fornisce una significativa riduzione dei costi. Qui, peptide innesto di chitosano è stato eseguito come precedentemente pubblicato 18. Come precedentemente dimostrato, questo approccio fornisce innesto semplice ed efficace utilizzando agenti di accoppiamento EDC-HCl (1-etil-3 (3- dimetilaminopropil) carbodiimide ) e NHS (N -hydroxysuccinimide) per funzionalizzare l&#39;acido carbossilico dei RGDS essere innestato sullapellicola chitosano. Due vantaggi di questo metodo sono innesto che non richiede alcuna modifica del chitosano o del peptide, e sono realizzati nel mezzo acquoso per massimizzare la compatibilità con le future applicazioni di coltura cellulare 18,20. Mentre gli agenti di accoppiamento e il peptide può essere caricata, CE è un metodo adatto per l&#39;analisi delle cinetiche di reazione. È importante sottolineare che l&#39;analisi delle cinetiche di reazione tramite CE consente il monitoraggio in tempo reale della reazione di innesto, e quindi permette sia ottimizzando e quantificare il grado di innesto. Mentre non è normalmente necessaria, i risultati dell&#39;analisi CE possono essere convalidati off-line da una misura diretta del peptide innesto su film chitosano utilizzando allo stato solido NMR (risonanza magnetica nucleare) spettroscopia 25,26 per dimostrare l&#39;innesto covalente del peptide sulla pellicola 18. Tuttavia, rispetto a stato solido spettroscopia NMR, l&#39;analisi in tempo reale fornito daCE consente la quantificazione del consumo peptide in tempo reale e quindi la capacità di valutare la cinetica di reazione. Il suddetto metodo è semplice e consente l&#39;analisi in tempo reale di peptide innesto su film chitosano con quantificazione indiretta del grado dell&#39;innesto. Il metodo illustrato può essere esteso alla valutazione quantitativa in tempo reale di diverse reazioni chimiche purché i reagenti oi prodotti da analizzare può essere caricato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Water</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chitosan powder (medium molecular weight)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>448877</td>
			<td style="width:479px;">lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">2-2.5L GL</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4540</td>
			<td>laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465&#160;</td>
			<td>laboratory reagent, corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RGDS&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:119px;">H&#8208;1155</td>
			<td>peptide, bought from Auspep Pty Ltd</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D80002</td>
			<td>Irritant to skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">130672</td>
			<td>Irritant to skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>466-500G</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>384-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium hydrogen phosphate - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>1234-500G</td>
			<td>laboratory reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>4745-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Oligoacrylate standard</td>
			<td style="width:185px;">custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BDH AnalR, Merck Pty Ltd</td>
			<td style="width:119px;">10058</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">A1367-2.5L</td>
			<td>laboratory reagent, corrosivie</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fused silica tubing</td>
			<td style="width:185px;">Polymicro (Molex)</td>
			<td style="width:119px;">TSP050375</td>
			<td style="width:479px;">Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 &#181;m internal diameter, 363 &#181;m outer diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 7100 CE</td>
			<td style="width:185px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G7100CE</td>
			<td>Capillary electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">KS260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Electronic balance</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;">MS204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Milli-Q Synthesis&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZMQS5VF01</td>
			<td>Ultrapure water filtration system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Parafilm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Labtek</td>
			<td style="width:119px;">PM966</td>
			<td>Parrafin wax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis to monitor peptide grafting onto chitosan films in real time

Free-soluzione elettroforesi capillare (CE) separa analiti, composti generalmente praticati in soluzione mediante l&#39;applicazione di un campo elettrico. Rispetto ad altre tecniche di separazione analitiche quali la cromatografia, CE è economico, robusto e non richiede alcuna preparazione del campione (per un numero di matrici naturali complesse o campioni polimerici) effettivamente. CE è veloce e può essere utilizzata per seguire l&#39;evoluzione delle miscele in tempo reale (per esempio, cinetica di reazione chimica), i segnali osservati per i composti separati sono direttamente proporzionali alla loro quantità in soluzione. Qui, l&#39;efficienza della CE è dimostrata per monitorare l&#39;innesto covalente di peptidi su film chitosano per successive applicazioni biomediche. proprietà antimicrobiche e biocompatibili di Chitosano rendono un materiale interessante per applicazioni biomediche come substrati di crescita cellulare. Covalente innestando le RGDS peptide (arginina - glicina -acido aspartico - serina) sulla superficie del film chitosano mira a migliorare l&#39;adesione cellulare. Storicamente, cromatografia e analisi amminoacidica sono stati utilizzati per fornire una misura diretta della quantità di peptide innestato. Tuttavia, la separazione rapida e assenza di preparazione del campione è fornito da CE permette il monitoraggio in tempo reale altrettanto precisa ancora del processo di innesto peptide. CE è in grado di separare e quantificare le diverse componenti della miscela di reazione: la (non innestate) peptide e gli agenti di accoppiamento chimici. In questo modo l&#39;uso di CE traduce in film perfezionati per applicazioni a valle. I film chitosano sono stati caratterizzati mediante spettroscopia NMR allo stato solido (risonanza magnetica nucleare). Questa tecnica è più tempo e non può essere applicato in tempo reale, ma produce una misura diretta del peptide e quindi convalida la tecnica CE.

CE è adatto a monitorare l&#39;innesto di peptidi (ad esempio, rgds) sul film chitosano. Agenti di accoppiamento adatti comprendono EDC-HCl e NHS che attivano il peptide ad essere innestati su chitosano (figura 1). CE è in grado di separare le diverse molecole di interesse dal mezzo di reazione. Per assegnare i picchi sul elettroferogramma, RGDS puri, EDC-HCl e NHS sono stati sciolti, iniettati e separati separatamente. Dopo l&#39;assegnazione dei picchi, il m...

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Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.0K Views.  Western Sydney University. Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

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A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Una tecnica di funzionalizzare e Self-montare macroscopiche nanoparticelle-ligando monostrato Films su substrati privi di modello

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

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Chimica

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

Raffreddamento Vota dipendenti Misure ellissometria per determinare la dinamica dei Thin Films Glassy

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l&#39;analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d&#39;esame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semi

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Grafting Multiwalled Carbon Nanotubes with Polystyrene to Enable Self-Assembly and Anisotropic Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a free-radical polymerization strategy to enable the modulation of the nanotube surface properties and produce supramolecular self-assembly of the nanostructures. First, a selective hydroxylation of the pristine nanotubes through a biphasic catalytically mediated oxidation reaction creates superficially distributed reactive sites at the sidewalls. The latter reactive sites are subsequently modified with methacrylic moieties using a silylated methacrylic precursor to create polymerizable sites. Those polymerizable groups can address further polymerization of styrene to produce a hybrid nanomaterial containing PS chains grafted to the nanotube sidewalls. The polymer-graft content, amount of silylated methacrylic moieties introduced and hydroxylation modification of the nanotubes are identified and quantified by Thermogravimetric Analysis (TGA). The presence of reactive functional groups hydroxyl and silylated methacrylate are confirmed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Polystyrene-grafted carbon nanotube solutions in tetrahydrofuran (THF) provide wall-to-wall collinearly self-assembled nanotubes when cast samples are analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Those self-assemblies are not obtained when suitable blanks are similarly cast from analogous solutions containing non-grafted counterparts. Therefore, this method enables the modification of the nanotube anisotropic patchiness at the sidewalls which results into spontaneous auto-organization at the nanoscale.

A procedure for the synthesis of polystyrene-grafted multiwalled carbon nanotubes using successive chemical modification steps to selectively introduce the polymer chains to the sidewalls and their self-assembly via anisotropic patchiness is presented.

L'innesto Multiwalled Carbon Nanotubes con polistirolo per abilitare l'auto-assemblaggio e discromie anisotropo

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Sorveglianza dei medicinali ad alta produttività e completa usando la spettrometria totale multisegmento elettroforesi di iniezione-capillare

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Elettroforesi capillare per monitorare Peptide innesto su Chitosano film in tempo reale

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