Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ciclo cellulare e sulla dinamica della popolazione delle cellule staminali della linea germinale in C.elegans. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede transgeni, è compatibile con la colorazione immunofluorescente e può essere modificata per studiare le cellule in molte condizioni diverse. Ero molto emozionato quando ho visto questo metodo usato per la prima volta nel laboratorio Scheda.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ciclo cellulare di C.elegans, può anche essere applicato a domande più ampie sull'invecchiamento, la nutrizione o i genotipi alterati. Generalmente i laboratori nuovi a questo metodo possono avere difficoltà con l'idiodisprepazione iniziale o la colorazione dell'ematossilina C.elegans. Iniziare utilizzando la tecnica sterile per aggiungere 200 microlitri di 10 millimolare EdU in 100 millilitri di tampone M9 e gli integratori appropriati a quattro millilitri di coltura MG 1693 E.coli appena coltivata durante la notte.
Fare idiodiscious richiede un delicato equilibrio tra EdU e completamento della timidina. Poiché la quantità di timidina deve essere sufficiente affinché l'E coli cresca bene, mentre la quantità di EdU deve essere sufficiente per il robusto scudo contro il livellamento. Dopo non più di 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 giri/min, utilizzare una tecnica sterile per dividere la coltura tra due o quattro tubi sterili conici da 50 millilitri per la centrifugazione.
Risostire la pellatina quattro millilitri di tampone M9 fresco e utilizzare la stessa pipetta per applicare circa 8 gocce di soluzione EdU etichettata E Coli MG1693 al centro delle singole piastre di petri di protezione M9 A a temperatura ambiente 60 millilitro. Per alimentare i batteri etichettati EdU ai nematodi, utilizzare PBS fresco per lavare i C.Elegans da un piatto medio di crescita nematode in un tubo da 1,5 millilitri e consentire agli animali di stabilirsi brevemente per gravità. Lavare gli animali una o due volte con un millilitro di PBS e utilizzare una pipetta pasteur di vetro per trasferire i nematodi sul centro del prato EdU in una piccola goccia di PBS.
Attendere alcuni minuti affinché il liquido venga assorbito e incubare la coltura per almeno 30 minuti a 20 gradi Celsius secondo il protocollo sperimentale. Alla fine dell'incubazione, utilizzare due millilitri di PBS per sciacquare i vermi dal piatto di coltura EdU in un piatto di sezionazione del vetro. Dopo la dissezione e la fissazione delle gonadi nematode come precedentemente descritto, sciacquare un piccolo tubo di vetro borosilicato millilitro e una lunga pipetta pasteur in vetro con PBS integrata con lo 0,1% tra 20 e utilizzare la pipetta per trasferire le gonadi fisse al tubo in una piccola quantità di pbs tween.
Raccogliere le gonadi per centrifugazione e utilizzare una pipetta da pascolo in vetro lunga e estratta per rimuovere il più supernatente possibile senza disturbare il pellet di gonad. Per il rilevamento EdU, aggiungere 100 microLitri di cocktail EdU click alle gonadi e coprire il tubo con pellicola di laboratorio per un'incubazione da 30 a 60 minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare le gonadi una volta con 100 microLitri di tampone di risciacquo di reazione e quattro volte con un millilitro di interpolazione PBS.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere al campione 25 microLitri di supporto anti-dissolvenza integrati con DAPI. Mentre il mezzo si sta depositando sulle gonadi, posizionare un grande pad di agarosio del 2,5% su uno scivolo standard al microscopio in vetro. Quindi appiattire con una seconda diapositiva.
Successivamente, utilizzare una lunga pipetta pasteur in vetro e mantenere tutto il liquido e le gonadi nella punta stretta della pipetta per ridurre al minimo la perdita del campione durante il trasferimento delle gonadi sul pad. Usando una ciglia incollata a uno stuzzicadenti, distribuire le gonadi sul tampone di agarosio e rimuovere eventuali particelle di polvere. Quindi abbassare lentamente una copertura rettangolare di vetro scivolare sulle gonadi, facendo attenzione a evitare bolle d'aria e rimuovendo qualsiasi soluzione in eccesso con un tessuto da laboratorio.
Contare le celle in tre dimensioni richiede in modo affidabile una certa pratica. L'uso del plug-in del contatore di celle delle Fiji e di uno script come contrassegna le celle per rimuovere eventuali duplicati aiuta a rendere riproducibili i conteggi. Dopo aver permesso al coperchio di depositarsi durante la notte, utilizzare il plug-in del contatore cellulare e le Figi per contare manualmente ogni nucleo, etichettando ogni singolo nucleo in base alla presenza o all'assenza di tre edu o etichettatura delle cellule della zona del pregenetore.
Il segnale EdU si co-localizza con il segnale DAPI. In alcuni nuclei, il segnale EdU copre tutti i cromosomi, mentre in altri nuclei, il segnale EdU localizza da uno a due punkta luminosi, probabilmente sul cromosoma X, che si replica alla fine della fase S. Il segnale EdU da un'etichettatura riuscita di 30 minuti localizza circa la metà dei nuclei nella zona del pregenetore.
Mentre la tecnica funziona costantemente in giovani animali adulti di tipo selvatico, una frazione significativa di ermafroditi accoppiati di 5 giorni non riesce a etichettare in un impulso EdU di 30 minuti. La durata del G2 può essere stimata analizzando la percentuale di nuclei nella fase M che sono edu positivi nel corso del tempo, permettendo il calcolo della durata mediana e massima di G2. La durata di G2 e G1 può essere stimata dalla percentuale di tutti i nuclei della zona del pregenetore positivi all'EdU, consentendo il calcolo della durata massima delle fasi combinate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare lo stesso lotto di piatti EdU per ridurre al minimo la variabilità inter-sperimentale.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione con anticorpi aggiuntivi o rispondere a domande aggiuntive sul ciclo cellulare, sul destino cellulare o sulle vie di segnalazione. Non dimenticare che lavorare con analoghi nucleicidi e parafermeldaide può essere pericoloso e che le precauzioni, come indossare guanti nitroli, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
