La fotoconversione fornisce un metodo in vivo tracciabile per l'analisi quantitativa dell'uscita dei leucociti per una visione meccanicistica della residenza dei leucociti e delle dinamiche di uscita da più siti tissutali in stati danneggiati. Bene, qui dimostriamo l'utilità del tracciamento dei leucociti dai tumori cutanei. L'applicazione di questo saggio ad altri tessuti e malattie è limitata solo dalla capacità di somministrare luce.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette la quantificazione delle popolazioni di cellule immunitarie endogene, piuttosto che trasferite come uscita dai tessuti infiammati in vivo. Per indurre l'infiammazione, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, utilizzare una micropipetta per somministrare 20 microlitri di ftalato di dibutile o DBP, al lato ventrale dell'pinna dell'orecchio di un topo transgenico Kaede anestetizzato. Dopo aver permesso al DBP di asciugarsi, tirare l'orecchio attraverso una fessura in un pezzo di foglio di alluminio e utilizzare nastro a doppia parte per fissare l'orecchio saldamente al foglio con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
Quindi, posiziona che sei direttamente sotto una sorgente luminosa di 405 nanometri e fotoconverti per tre minuti a 100 milliwatt di potenza. Per l'infezione da vaccinia, utilizzare una micropipetta per somministrare 5 volte 10 alla 6a placca formando unità del virus vaccinia in 10 microlitri di PBS sulla pinna dell'orecchio di un topo transgenico Kaede anestetizzato e colpire la pinna 25 volte. 24 ore dopo, fotoconverti la pinna come appena dimostrato.
Nel momento sperimentale appropriato, raccogliere i linfonodi pinna e cervicale e inguinale e utilizzare due paia di pinzette per smontare il lato ventrale e dorsale di ogni pinna. Quindi posizionare i linfonodi e i pezzi pinna, con l'interno dell'orecchio rivolto verso il basso, in singoli pozzi di una piastra da 24 pozzetti contenente 1 milligrammo per millilitro di Collagenasi D e 80 unità per millilitro di Dnasio diluito in HBSS contenente calcio e magnesio. Utilizzare due aghi calibro 29 per stuzzicare ogni capsula linfonodo e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, premere i tessuti pinna e linfonodo digeriti attraverso filtri cellulari in nylon da 70 Micron separati per ottenere sospensioni a singola cellula di ciascun tessuto. Quando i tumori sono cresciuti fino alle dimensioni sperimentali appropriate, radere qualsiasi pelliccia appena ricrescita intorno al sito tumorale e tirare il tumore attraverso un foro circolare tagliato in un pezzo di foglio di alluminio. Posizionare il tumore direttamente sotto la sorgente luminosa di 405 nanometri e fotoconvertire per 5 minuti a 200 milliwatt di potenza.
24 ore dopo la fotoconversione, raccogliere i tumori e i linfonodi brachiali e inguinali da ogni animale e utilizzare le forbici per tritare i tumori all'interno di singoli pozzi di una piastra di 24 po 'contenente Collagenasi D e DNasi in HBSS. Posizionare i linfonodi in pozzi separati e stuzzicare aprire le capsule come appena dimostrato. Dopo aver incubato i tumori per un'ora e i linfonodi per mezz'ora a 37 gradi Celsius, premere i tessuti digeriti attraverso filtri separati da 70 Micron per ottenere sospensioni a singola cellula di ciascun tessuto.
Per analizzare le sospensioni a singola cellula per citometria a flusso, raccogliere prima la milza o il sangue da un topo transgenico Kaede e liscicolare i globuli rossi con tampone di potassio cloruro di ammonio. Dividere le cellule in un FITC Kaede non convertito e una popolazione kaede PE convertita e rimescolare le cellule Kaede PE a singolo colore in un millilitro di PBS in un pozzo di una piastra di 24 pozzetti, quindi fotoconvertire le cellule per 5 minuti sotto una sorgente luminosa di 405 nanometri a 100 milliwatt di potenza. Successivamente utilizzare le celle Kaede PE fotoconvertite e le celle FITC Kaede non convertite per impostare le tensioni fotomoltiplicatorie sul 70-80% dell'intervallo totale di ogni canale fluorescente.
Una volta impostate le tensioni per le proteine Kaede, compensare tutte le altre macchie di anticorpi primari utilizzando singole perline di compensazione etichettate al fluoroforo, secondo le istruzioni del produttore. Quindi, eseguire i campioni sul citometro di flusso in base ai protocolli di analisi citometrica del flusso standard. Le sospensioni a singola cellula generate dalla pelle dell'orecchio o dai linfonodi drenante cervicali immediatamente dopo l'esposizione alla fotoconversione rivelano un'efficienza di conversione del 78% di tutti i leucociti positivi CD45 nella pelle, senza cellule convertite osservate nei linfonodi drenante.
La quantificazione del numero di leucociti positivi cd45 infiltrati nelle orecchie fotoconvertite zero e 24 ore dopo la conversione, rivela che l'esposizione alla luce viola causa un aumento statisticamente significativo dell'infiltrazione di leucociti. Questo aumento dell'infiltrazione positiva di leucociti CD45, tuttavia, è piccolo rispetto all'infiltrazione indotta da un potente stimolo infiammatorio come il virus vaccinia. La fotoconversione aumenta anche la permeabilità vascolare nella pinna dell'orecchio misurata dal saggio Miles, indicando insieme che gli effetti della luce viola sull'infiammazione dei tessuti dovrebbero essere considerati quando si ottimizzano la dose, il tempo di esposizione e l'interpretazione dei dati.
L'analisi citometrica del flusso delle cellule tumorali dissociate dagli animali fotoconvertiti rivela una significativa conversione delle cellule positive intratumorali CD45 da Kaede FITC positivo a Kaede PE positivo, mentre le cellule linfonodo drenante rimangono non convertite. L'efficienza di fotoconversione dei leucociti positivi cd45 variava significativamente tra i tipi e le dimensioni tumorali, con i leucociti positivi CD45 all'interno di piccoli tumori del melanoma che dimostravano la fotoconversione più efficiente. Con l'aumento dei volumi tumorali, l'efficienza di conversione diminuisce a circa il 50%In particolare, la melanina ha un impatto sorprendente sull'efficienza della fotoconversione con una fotoconversione massima delle cellule positive CD45 osservata all'interno di tumori che producono melanina di appena il 30% nei tumori più piccoli, che scende al 10% man mano che i volumi tumorali si avvicinano ai 400 millimetri cubi.
L'esame dei linfonodi che drenano il tumore 24 ore dopo la fotoconversione rivela la presenza di cellule immunitarie positive rosse Kaede di vari fenotipi, dimostrando così l'emigrazione dei leucociti dal tumore fotoconvertito. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per scoprire la cinetica dello stato stazionario e il turnover infiammato dei leucociti nel tessuto periferico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che solo il tessuto di interesse sia fotoconvertito, poiché la fotoconversione involontaria del tessuto circostante comprometterà i risultati.
Gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero ottimizzare il tempo di esposizione per la conversione del loro tessuto, così come la durata delle volte prima che si verifichi la raccolta dei tessuti in base alla dinamica del leucocita di interesse.
