L'obiettivo generale del protocollo basato sulle cellule è isolare e colturare le cellule di melanociti umani, migliorando le carenze dei metodi convenzionali. Dal nuovo metodo possiamo ottenere maggiori quantità di cellule di melanociti primari in un tempo relativamente breve, in base a materiali e attrezzature. I tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono adulti freschi per tessuti della pelle scartati dalla chirurgia della circoncisione in ospedale e trattati secondo le linee guida del Comitato etico per la ricerca umana dell'istituzione numero 2015120401, data 12 maggio 2015.
Questa è una visualizzazione di tutti i reagenti richiesti. Preparare strumenti e materiali sterili in anticipo e impostare il tessuto in un piatto, lavare il tessuto con 75%etanolo per 30 secondi e con la soluzione lavaggi lega cinque minuti ciascuno taglia il tessuto in pezzi convenienti e rottamare il tessuto con lama chirurgica per rimuovere lo strato di grasso. Appiattire i tessuti con il lato derma verso il basso aggiungere 2,5 milligrammi per millilitro la soluzione spaziale ai tessuti della pelle.
Coprire e conservare i pezzi a quattro gradi centigradi durante la notte. Il secondo giorno, staccare l'epidermide dal derma e trasferire immediatamente l'epidermide in altri tre piatti con soluzione di lavaggio a sua volta immergendo lo 0,05% di tripside nel tubo incubato per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Aggiungere un volume uguale della soluzione di neutralizzazione.
Pipetta la soluzione su e giù per 10-15 volte. Passare la soluzione attraverso un filtro mash da 100 micrometri. centrifuga a 200 volte g per cinque minuti rimuovere il supernatante ri-sospendere il pallet cellulare in 10 millilitri di mezzo tiva.
Aggiungere 10 micrometri di Y-27632. Contrassegnare le informazioni questo è il campo visivo al microscopio. Mostra cellule che galleggiano nell'incubazione media in un incubatore di 37 gradi centigradi.
Questa vista mostra la vista il secondo giorno in cui le celle hanno iniziato ad attaccare la parte inferiore del piatto. E la vista del nono giorno mostra l'esistenza di evidenti depositi di melanociti. Rimuovere il supernatante lavare le cellule con PBS aggiungere due millimetri dello 0,05% di tripside incubare le cellule per due minuti aggiungere due millilitri della soluzione di neutralizzazione.
centrifuga a 200 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante sospendendo lentamente il pallet cellulare con 10 millimetri di mezzo tiva. Cambia il mezzo ogni due giorni.
Queste immagini mostrano le viste del passaggio un diagramma schematico in modo che il nuovo metodo e il metodo convenzionale siano presentati in questa figura. La procedura per la preparazione dei tessuti e la digestione di un nuovo metodo è la stessa del metodo convenzionale. L'unica differenza è che le cellule adipose isolate inoculate in 10 minuti nel suo mezzo tiva con la presenza di 10 micrometri Y-27632.
Dopo due giorni sostituire il supporto con tiva medium senza integratori a Y-27632. Questo pannello mostra immagini rappresentative di melanociti preparati con il metodo convenzionale riga superiore e con il nuovo metodo riga inferiore al terzo giorno, giorno sei e giorno otto dopo l'inoculazione iniziale chiamiamo il numero di melanociti al terzo giorno, sesto e otto giorno, abbiamo scoperto che il nuovo metodo ha aumentato la resa dei melanociti di circa cinque volte. Dopo otto giorni di contatore ne abbiamo fatto dozzine e contando il numero di melanociti in ogni singolo piatto.
I risultati hanno mostrato che il numero di melanociti isolati con un nuovo metodo è molto più del metodo convenzionale. Ki67 in piedi conferma che i melanociti isolati con un nuovo metodo possono normalmente proliferare più importante, abbiamo ottenuto la normale funzione dei melanociti con il nuovo metodo. Abbiamo controllato la purezza dei melanociti dopo il passaggio iniziale dall'isolamento.
Il passaggio per cui si melanciti sta per espressione MITF che si esprime solo nei melanociti. E abbiamo scoperto che quasi il 100% delle cellule era positivo per il MITF indicando melanociti puri ottenuti dopo il primo passaggio. Per testare i melanociti isolati dai nuovi metodi può funzionare normalmente.
Abbiamo trattato i melanociti con raffreddamento a forza per oltre 90 in vitro e osserviamo che il raffreddamento della forza può indurre la pigmentazione dei melanociti. L'unione di questi dati suggerisce che i melanociti isolati dal nuovo metodo possono normalmente produrre pigmentazione. I melanociti primari, come indicato sopra la pelle ed estesi in coltura, sono stati prontamente utilizzati per la ricerca di laboratorio e le applicazioni cliniche.
Dopo aver riportato quell'ID Y-27632 nel mezzo di coltura iniziale prima di due giorni può aumentare drasticamente l'out of melanocytes. In sintesi, abbiamo stabilito con successo un nuovo metodo semplice e altamente efficiente per isolare i melanociti primari puri dai tessuti adulti.
