Questo protocollo consente ai ricercatori di monitorare la sopravvivenza su una singola cellula e identificare variabili che predicono significativamente la morte o la sopravvivenza cellulare. I test di citotossicità convenzionali valutano le popolazioni di cellule e mancano della capacità di discriminare le singole cellule. La microscopia longitudinale consente l'assegnazione del tempo di morte per ogni cellula in una popolazione.
Questa tecnica è adatta per valutare nuove terapie per malattie neurodegenerative e altre condizioni. Questo metodo si è dimostrato prezioso per esplorare i meccanismi della malattia in condizioni neurodegenerative e potrebbe essere applicato con uguale efficacia verso altri disturbi in cui la morte cellulare è di interesse. I ricercatori possono avere difficoltà a raggiungere adeguate efficienze di trasfezione senza tossicità indebita.
La pratica con la pipetta multicanale e la familiarità con il protocollo dovrebbero diminuire queste difficoltà nel tempo. La microscopia è una metodologia intrinsecamente visiva. Pertanto, la tecnica può essere più facilmente compresa guardando oltre alla lettura.
Per iniziare, combinare la quantità appropriata di mezzi siere ridotti e reagente di trasfezione in un unico tubo e ridurre i mezzi siere e il DNA in un tubo separato. Incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
Utilizzare una pipetta multicanale e trogoli di plastica steril per lavare i neuroni corticali due volte con 100 microlitri di mezzi basali neurali per pozzo. E conservare i supporti condizionati e altri supporti rimanenti a 37 gradi Celsius. Sostituire l'NBM con 100 microlitri di soluzione NBKY precedentemente preparata per pozzo.
Dopo 20 minuti, pipettare 50 microlitri del reagente di trasfezione e miscela di DNA dropwise in ogni pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Risciacquare le cellule due volte con la soluzione NBKY.
Quindi aggiungere 100 microlitri di supporti condizionati e 100 microlitri di soluzione NBC ai pozzi. Per iniziare a immaginare le cellule, posizionare la piastra del pozzo 96 su un microscopio fluorescente. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro.
Quindi, passare alle aree di interesse e registrare le coordinate x e y relative al segno. Utilizzare un segno fiduciario univoco per ogni lastra come riferimento per l'allineamento futuro e salvare un'immagine come riferimento futuro. Infine, concentrati sulle cellule trasfette che esprimono un'etichetta fluorescente.
Scatta più immagini a intervalli regolarmente distanziati nei canali fluorescenti appropriati. Per iniziare con l'elaborazione delle immagini, fai doppio clic sull'icona delle Fiji. Quindi, fare clic e trascinare la macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine sulla barra delle Fiji per aprire la macro all'interno delle Figi.
Regolare le righe da due a sette della macro di elaborazione del carattere di sottolineatura dell'immagine in base al protocollo di testo. Quindi, fare clic su cuciture, quindi griglia / cuciture di raccolta. Regolare le impostazioni all'interno dei menu a discesa, digitare e ordinare, fino a produrre un'immagine cucita con precisione.
Regolare il tipo di griglia e le variabili dell'ordine di punto nelle righe otto e nove in base a queste selezioni. Quindi, regola la riga 10 per specificare il numero di immagini per pozzo e imposta l'opzione di sottrazione di sfondo nella riga 14 su true, se necessario. Regolare la riga 15 per impostare il raggio della palla rotolante in base al protocollo di testo e fare clic su Esegui.
Infine, aprire gli stack di immagini di output e identificare manualmente i neuroni morti in base al protocollo di testo. Registrare i dati in un file di foglio di calcolo. Per eseguire analisi statistiche, fare doppio clic sull'icona per la sopravvivenza.
R script. Evidenziare la linea due e fare clic sul pulsante esegui per caricare la libreria di sopravvivenza. Quindi, modificare il percorso nella riga cinque per chiamare il foglio di calcolo di input e fare clic sul pulsante esegui.
Evidenziare le linee otto e nove e fare clic sul pulsante esegui per eseguire l'analisi dei pericoli proporzionali Cox. Evidenziare le linee da 12 a 16 e da 19 a 24. Fare clic sul pulsante esegui per tracciare il rischio cumulativo di morte e i dati di sopravvivenza come curva kaplan-meier.
In questo studio, i neuroni corticali del ratto sono stati trasfettato a quattro giorni dopo la placcatura con un plasmide che codifica per la proteina fluorescente M mela. 24 ore dopo la trasfezione, i neuroni sono stati imageati dalla microscopia a fluorescenza ogni 24 ore per 10 giorni consecutivi. A seguito dell'acquisizione dell'immagine, le immagini sono state elaborate e sono state esaminate in sequenza per celebrare la morte cellulare.
Il tempo di morte per ogni cellula era determinato da cambiamenti nella fluorescenza, morfologia e frammentazione del corpo cellulare. L'analisi dei pericoli proporzionali cox eseguita sui dati di sopravvivenza dei neuroni mutanti ha portato ad un rapporto di pericolo di 2,2. Questo risultato ha indicato un tasso di morte più veloce nei neuroni mutanti rispetto alla popolazione di tipo selvaggio.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è quella di pipet con attenzione. Ridurre al minimo l'esposizione all'aria ed evitare le bolle è fondamentale per una trasfezione di successo. Dopo la trasfezione, la microscopia a fluorescenza longitudinale può essere utilizzata per tenere traccia di vari fattori che possono contribuire alla morte cellulare, tra cui localizzazione proteica, turnover e livello di espressione, oltre alla sopravvivenza cellulare.
Nel campo della neurodegenerazione, la natura dinamica della microscopia longitudinale ha fatto luce sul fatto che l'aggregazione di proteine associate alla malattia rappresenti un evento tossico o protettivo. Nessuno di questi reagenti o strumenti è pericoloso.
