Il protocollo che presentiamo qui è un semiconduttore rapido e a basso costo, metodi basati sul sequenziamento per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni. Il protocollo perfezionato per l'esecuzione dell'amplificazione dei modelli e le disposizioni della libreria di sequenziamento rendono il rilevamento PGTA riproducibile, ad alta velocità effettiva, economico e risparmio di tempo. Il runtime di questo sequenziatore semiconduttore è di solo due o quattro ore.
Riduzione dei tempi di consegna dalla ricezione dei campioni all'emissione di report in cinque giorni. Questo metodo fornisce il sequenziamento del genoma per lo screening dell'aneuploidia, la variazione del numero di copia e le chiamate al polimorfismo mono nucleotidico. A causa della diversa chimica del sequenziamento, la libreria preparata da questo protocollo non può essere sequenziata direttamente su altri sistemi di sequenziamento.
Ma lo stesso sequencer, ma diversa preparazione della libreria, è in grado di eseguire screening prenatali non invasivi. A dimostrare la procedura sarà Xiangchun Guo, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare il sequenziamento, vortice ogni libreria diluita e girare brevemente quattro volte sulla mini centrifuga per tre secondi ogni volta.
Quindi, prendi cinque microlitri di ogni libreria, per mettere in comune nel tubo senza nucleo, un punto cinque millilitri. Vortice la libreria mista e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di rottura a due nuovi tubi di recupero.
Installare i nuovi tubi di recupero, il router di recupero e la piastra di amplificazione. Mescolare invertendo la bottiglia d'olio tre volte. Assicurarsi che sia l'olio che la soluzione di recupero siano pieni di almeno due terzi.
Vortice il buffer PCR master mix per 30 secondi e ruotare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Vortice le particelle di sfera e la libreria mista per un minuto e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Successivamente, preparare un mix di li legatura di 2400 microlitri, aggiungendo 172 microlitri di acqua priva di nucleasi, otto microlitri della libreria mista, 120 microlitri del mix enzimatico e 100 microlitri delle particelle di sfera, al tubo contenente 2000 microlitri del buffer PCR master mix.
Impostare una pipetta su 800 microlitri e caricare la miscela di legatura sul filtro di reazione attraverso la porta del campione. Invertire la bottiglia d'olio tre volte e utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere 200 microlitri dell'olio di reazione al filtro di reazione. Selezionare il programma Proton e quindi selezionare il pulsante assistito, per assicurarsi che il dispositivo sia stato impostato correttamente, seguendo le istruzioni sul monitor.
Quindi fare clic su Avanti per avviare il programma. Caricare 100 microlitri del campione di prodotto PCR emulsione, 130 microlitri delle perline lavate, 300 microlitri della soluzione di lavaggio ES e 300 microlitri della soluzione melt-off nella striscia a otto tubi. Posizionare la striscia a otto tubi sul sistema di arricchimento.
Installare una punta di pipetta e un nuovo tubo a due millilitri a punto zero e avviare il programma. Centrifuga il tubo a due millilitri a zero punti a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e tenere dieci microlitri del prodotto di arricchimento.
Aggiungere 200 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Centrifuga di nuovo il tubo a due millilitri a punto zero. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del prodotto di arricchimento.
Aggiungere 90 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Per preparare il modello, vortice il controllo positivo e girare brevemente. Aggiungere cinque microlitri del controllo positivo a 100 microlitri del prodotto di arricchimento.
Vortice e centrifuga a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del modello. Aggiungere quindi 20 microlitri del primer di sequenziamento e 15 microlitri del buffer di ricottura al tubo del modello.
Vortice il tubo e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Incubare il tubo in un ciclore termico con un coperchio riscaldato. Quindi aggiungere 10 microlitri del buffer di carico al tubo.
Mescolare pipettando su e giù. Mescolare i 55 microlitri del campione tubazioni su e giù e caricare il campione sul pozzo di carico del chip. Mantenere la punta della pipetta usata e il tubo PCR a due millilitri a punto zero.
Posizionare il chip sulla mini centrifuga del chip quando un campione entra nel chip. Controllare la posizione e centrifugare il truciolo per 10 minuti. Preparare il tampone di ricottura al 50% aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di acqua priva di nucleasi in un tubo di un punto cinque millilitro.
Preparare la soluzione di lavaggio, aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di 100%2-propanolo in un tubo da un punto cinque millilitri. Quindi, preparare la miscela schiumografica, aggiungendo 49 microlitri del tampone di ricottura del 50% e un microlitro della soluzione schiumografica a due nuovi tubi da un punto cinque millilitri. Pipettare l'aria in una delle miscele schiumosi e caricare 120 microlitri delle bolle nel pozzo di carico.
Trasferire il liquido espulso eccessivo dall'uscita al pozzo di carico e centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip. Ripetere il processo per la seconda miscela schiumosa. Aggiungere 55 microlitri del tampone di ricottura del 50% al tubo di due millilitri mantenuto a zero punti.
Utilizzare la punta della pipetta mantenuta per pipettare su e giù. Caricare tutti i 55 microlitri del tampone di ricottura sul pozzo di carico. Centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip designata.
Caricare 100 microlitri della soluzione di lavaggio nel pozzo di caricamento del truciolo e scartare il liquido espulso dal pozzo di uscita. Ripetere questa fase di caricamento una volta. Caricare 100 microlitri del buffer di ricottura del 50%, nel pozzo di caricamento del truciolo.
Ripetere questo passaggio di caricamento per un totale di tre volte. Aggiungere 60 microlitri del tampone di ricottura del 50% e sei microlitri dell'enzima di sequenziamento in un nuovo tubo millilitro di un punto cinque. Mescolare pipettando su e giù.
Pipettare lentamente 65 microlitri di questa soluzione mista nel pozzo di caricamento del truciolo, evitando bolle. Tenere il chip lontano dalla luce e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Infine, dopo l'incubazione, caricare immediatamente il chip sul sequencer e fare clic su Avvia l'esecuzione del sequenziamento sullo schermo per iniziare a sequenziare.
Un'analisi statistica retrospettiva su 186 fasi di scissione e 1135 embrioni in stadio di blastocista ha portato a tassi di successo del WGA di oltre il 95% in entrambi i tipi di campioni. I tassi di guasto del controllo di qualità di sequenziamento sono stati del 3,4% nel gruppo di fase di scissione e solo dell'1,9% nel gruppo di fase blastocista. Oltre all'aneuploidia, i dati di sequenziamento possono essere utilizzati per altre analisi.
Ad esempio, copiare le variazioni di numero con una dimensione inferiore a cinque megabase, o analisi del DNA mycondrial, a seconda della profondità e della qualità del sequenziamento. Con il miglioramento della chiamata del numero di copie, i ricercatori possono indagare ulteriormente il futuro del mosaicismo cromosomico negli embrioni umani allo stadio iniziale.
