Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV, come determinare la composizione genetica dei provirus hiv e dei diversi tipi di cellule. Identificare in particolare quelli geneticamente intatti e potenzialmente competenti per la replicazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di amplificare quasi a figura intera i provirus hiv da singole cellule infettate da HIV e quindi sequenziarli entro il sequenziamento di prossima generazione.
Per iniziare, preparare tutti i buffer come descritto nel protocollo di testo. Ottenere un pellet cellulare e aggiungere cento microlitri di tampone dilisi per milione di cellule. Mescolare pipettando su e giù.
Lisci le cellule incubando in un ciclore termico a 55 gradi Celsius per un'ora e quindi aggiungere 85 gradi Celsius per 15 minuti. Per iniziare ad amplificare singoli provirus del DNA HIV-1 mescolare i reagenti per la PCR del primo ciclo come elencato nella tabella uno del protocollo di testo. Aggiungere 38 microlitri a 85 pozzali in una piastra PCR da 96 po' ed etichettare questa piastra come PCR 1.
Successivamente, spostare la piastra PCR 1 in un'area chiara designata per l'aggiunta di DNA genomico. L'uso del tricloruro diluisca serialmente il DNA genomico da un rapporto da uno a tre a un rapporto da uno a 81 assicurandosi di preparare 45 microlitri di ogni diluizione. Aggiungere due microlitri di DNA genomico diluito a ciascun pozzo campione e due microlitri di tricloruro ad ogni pozzo di controllo negativo.
Sigillare l'intera piastra ad eccezione del pozzo di controllo positivo. Passare quindi a un'area designata per l'aggiunta del controllo positivo. Aggiungere due microlitri del controllo positivo al pozzo corrispondente e quindi sigillare completamente la piastra.
Utilizzare uno spinner a piastre PCR per ruotare brevemente la piastra PRC 1 ed estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali. Eseguire la piastra PCR 1 nel ciclore termico come indicato nel protocollo di testo. Quindi, mescolare i reagenti per il secondo ciclo di PCR come elencato nella tabella uno.
Aggiungere 28 microlitri di questo mix PCR 2 a 85 pozzali di una nuova piastra PCR da 96 poggi. Etichettare questa piastra come PCR 2. Utilizzando uno spinner a piastre, ruotare brevemente la piastra PCR 1 per estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali.
Aggiungere 80 microlitri di tris cloridrato ad ogni pozzo di questa piastra. Successivamente, utilizzare una pipetta a canale mutli per trasferire due microlitri da ogni pozzo della piastra PCR 1 ai pozzi corrispondenti nella piastra PCR 2. Sigillare la piastra PCR 2 con involucro adesivo chiaro.
Ruotare brevemente la piastra PCR 2 nello spinner della piastra. Nel frattempo, sigillare la piastra PCR 1 con una pellicola termosigillante per la conservazione a lungo termine a meno 20 gradi celsius. Eseguire la piastra PCR 2 in un ciclore termico come indicato nel protocollo di testo.
Quindi ruotare brevemente la piastra PCR 2 per estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzi. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 60 microlitri di tris cloridrato ad ogni pozzo. Successivamente, eseguire 15 microlitri di ciascun pozzo su due gel di agarosio dell'uno per cento ben prefabbricati che contengono bromuro di etidio.
Identificare i pozzi contenenti il prodotto amplificato e le loro dimensioni approssimative e salvare l'immagine del gel. Successivamente, determinare la diluizione alla quale non più del 30% dei pozzi sono positivi per il prodotto amplificato. In primo luogo, utilizzare uno spinner a piastre per ruotare brevemente la piastra PCR 2 ed estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali.
Trasferire 40 microlitri dai pozzi contenenti prodotto amplificato ai pozzi corrispondenti di una nuova piastra midi da 96 pozza. Successivamente, impostare un kit di purificazione a base di alimentazione magnetica assicurandosi di portare le perline magnetiche a temperatura ambiente e preparare una soluzione fresca dell'80% di etanolo. Una volta che le perline raggiungono il vortice a temperatura ambiente, assicurarsi che vengano completamente rimorsi.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di perline ai 40 microlitri di prodotto amplificato in ogni pozzo della piastra midi. Mescolare con pipettando delicatamente su e giù 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Quindi, trasferire la piastra su un supporto magnetico e lasciarla riposare per due minuti. Successivamente, rimuovere e scartare il supernatante. Con la piastra ancora sul supporto, lavare le perline aggiungendo duecento microlitri della soluzione di etanolo all'80% ad ogni pozzo.
Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi rimuovere e scartare il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio una volta dall'aggiunta dell'etanolo allo scartamento del supernatante. Utilizzando una pipetta multicanale rimuovere l'etanolo in eccesso.
Lasciare asciugare le perline all'aria per 15 minuti. Dopo questo, rimuovere la piastra dal supporto. Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione ad ogni pozzo e mescolare tubazione delicatamente su e giù 10 volte.
Incubare a temperatura ambiente per due minuti. Riposizionare la piastra sul supporto magnetico e lasciarla riposare per due minuti. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 25 microlitri del supernatante ai pozzi corrispondenti di una nuova piastra PCR da 96 potte.
Successivamente, utilizzare un fotometro spettrale per determinare e registrare la concentrazione approssimativa di ogni prodotto DNA amplificato. Impostare un kit di quantificazione del DNA a doppio filamento e diluire il buffer a una volta in acqua sterile priva di DNA. Aggiungere 99 microlitri del tampone a un numero appropriato di pozzi vuoti in una piastra di coltura del tessuto inferiore piatto.
Quindi, aggiungere cento microlitri di buffer a tre pozzi vuoti. Per misurare ogni prodotto amplificato aggiungere un microlitro di DNA purificato in triplice copia ad ogni tampone ben contenente. Diluire il DNA a doppio filamento lambda 10 volte da due nanogrammi per microlitro al punto zero nanogrammi per microlitro per preparare gli standard.
Aggiungere cento microlitri di ogni standard di DNA a doppio filamento a tre pozzi. Diluire il colorante di florescence da uno a duecento con tampone. Aggiungere rapidamente cento microlitri a ciascun pozzo che contiene un campione, vuoto o standard e mescolare pipettando su e giù.
Successivamente, coprire la piastra con un foglio per evitare il contatto con la luce. Utilizzando un lettore di micropiatte, registrare l'emissione di florescence. Utilizzare le misurazioni registrate per determinare la concentrazione di DNA a doppio filamento in ogni campione.
Quindi diluire ogni prodotto purificato con acqua a una concentrazione di zero punti due nanogrammi per microlitro. Dopo la PCR annidata, i prodotti amplificati vengono eseguiti su un gel di agarosio dell'uno per cento. La qualità iniziale della PCR può essere determinata ispezionando i controlli.
Poiché i controlli negativi contenenti prodotto amplificato indicano la contaminazione e i controlli positivi senza prodotto amplificato indicano un'amplificazione insufficiente. Solo i pozzi eseguiti alla diluizione del punto finale che contengono singoli provirus amplificati sono considerati per il sequenziamento. Mentre i pozzi contenenti più provirus amplificati di diverse lunghezze possono essere visualizzati in questa fase, non devono essere selezionati per il sequenziamento.
Per l'assemblaggio de novo, la qualità dei contig assemblati può essere valutata per una profondità e un'evenienza sufficienti di copertura. Le popolazioni miste possono anche essere identificate in questa fase dalla presenza di una copertura irregolare. La rappresentazione visiva delle sequenze isolate da un partecipante rivela che il 97% delle loro sequenze sono difettose.
Con sequenze intatte trovate in effector e memoria transitoria CD4 cellule T positive. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che solo i prodotti amplificati ottenuti alla diluizione limitante, cioè dove non più del 30% dei pozzi sono positivi, contengono un singolo provirus. Seguendo questa procedura, i prodotti amplificati possono essere sequenziati per determinare la composizione genetica dei provirus HIV.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV per esplorare la distribuzione di provirus HIV geneticamente intatti e diversi tipi di cellule nei pazienti in terapia per determinare dove si nascondono provirus competenti geneticamente intatti e potenzialmente replicanti. Non dimenticare che lavorare con cellule infettate da HIV può essere pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale appropriati e lavorare in un laboratorio certificato dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
