Il sequenziamento nanopore di terza generazione è una potente tecnologia di sequenziamento dei nuovi che consente di ottenere molto facilmente informazioni sulla sequenza da un'ampia varietà di campioni. I principali vantaggi di questa tecnica sono la portabilità del dispositivo di sequenziamento, la lunghezza di lettura estremamente lunga e la disponibilità in tempo reale dei dati. Il sequenziamento dei nanopore è una tecnologia particolarmente utile durante le epidemie in luoghi remoti.
È stato utilizzato con successo nei laboratori sul campo durante e dopo le epidemie di virus Ebola nell'Africa occidentale e centrale. Tramite il sequenziamento delle nanospore e l'uso del dispositivo MinION per questo scopo è piuttosto facile, bisogna fare attenzione durante la preparazione della libreria e durante il caricamento delle celle di flusso. Per iniziare questa procedura, impostare un PCR touchdown per amplificare il cDNA con primer impostato uno utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà hot start con il buffer di reazione appropriato in un volume di reazione di 50 microliter con un modello di microlitro.
Se possibile, impostare la reazione sul ghiaccio o in un blocco fresco a quattro gradi Celsius. Incubare la reazione in un termociclo come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, trasferire 50 microlitri del prodotto PCR in un tubo di reazione a bassa legatura del DNA da 1,5 millilitri.
Rimospendare accuratamente le perline magnetiche con il vortice. Quindi aggiungere 50 microlitri di perline alla reazione PCR e mescolare bene. Incubare il campione su un miscelatore rotante per cinque minuti a temperatura ambiente mentre si ruota a 15 giri/min.
Ruotare brevemente il campione e quindi posizionare il tubo su un rack magnetico per pellettare le perline magnetiche. Attendere che il supernatante sia stato completamente chiarito prima di continuare. Quindi, aspirare il supernatante senza disturbare il pellet di perline e scartarlo.
Pipettare 200 microlitri di 70%etanolo nel tubo di reazione e incubare per 30 secondi a temperatura ambiente. Aspirare l'etanolo senza disturbare il pellet di perline e scartarlo. Ripetere questo processo di lavaggio con etanolo ancora una volta per un totale di due lavaggi.
Asciugare all'aria il pellet per un minuto a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il tubo di reazione dal rack magnetico. Rimescolare il pellet in 30 microlitri di acqua priva di nucleasi e incubare a temperatura ambiente per due minuti.
Riposizionare il tubo di reazione sul rack magnetico e attendere che le perline di reazione siano completamente pellettate. Successivamente, rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet e trasferirlo in un nuovo tubo di reazione da 1,5 millilitri. Se più campioni devono essere sequenziati contemporaneamente, i codici a barre possono ora essere aggiunti da due passaggi PCR aggiuntivi seguiti dalla pulizia del DNA come mostrato in precedenza.
In primo luogo, combinare una quantità uguale di DNA codificato a barre da ogni campione per un totale di un microgrammo di DNA in un volume di 45 microlitri in un tubo di reazione da 0,2 millilitri. Per dA-Tailing, aggiungere sette microlitri di tampone di reazione di preparazione finale, tre microlitri della miscela enzimatica di preparazione finale e cinque microlitri di acqua libera da nucleasi. Scorrere delicatamente il tubo per mescolare.
In un termociclo, incubare la reazione per cinque minuti a 20 gradi Celsius seguita da cinque minuti a 65 gradi Celsius. Eseguire quindi la purificazione PCR del prodotto di reazione come descritto nel protocollo di testo. Facoltativamente, prendere un microliter per quantificare la concentrazione del campione utilizzando uno spettrofotometro UV.
Unire 22,5 microlitri del DNA purificato precedentemente ottenuto con 2,5 microlitri di adattatore 1D2 e 25 microlitri di Blunt/TA Ligase Master Mix in un nuovo tubo di reazione a bassa legatura del DNA da 1,5 millilitri. Scorrere delicatamente il tubo per mescolare. Far girare brevemente la miscela e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi eseguire la purificazione PCR del prodotto di reazione come descritto nel protocollo di testo. Combina 45 microlitri del prodotto di reazione con cinque microlitri di miscela di adattatori per codici a barre e 50 microlitri di Blunt/TA Ligase Master Mix in un tubo di reazione a bassa legatura del DNA. Scorrere delicatamente per mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Purificare il prodotto di reazione come descritto nel protocollo di testo e conservare il prodotto risultante sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Per iniziare, eseguire un controllo di qualità sulla cella di flusso prima dell'uso. A tal fine, collegare il dispositivo di sequenziamento al computer host e aprire il software.
Inserire una cella di flusso nel dispositivo di sequenziamento. Quindi scegliere il tipo di cella di flusso dalla casella del selettore e fare clic su disponibile per confermare. Nella parte inferiore dello schermo fare clic su Controlla cella di flusso e scegliere il tipo di cella di flusso corretto.
Fare clic su avvia test per avviare il controllo qualità. È necessario un minimo di 800 nanopori attivi in totale affinché la cellula di flusso sia utilizzabile. Per prima cosa, apri il coperchio della porta di adescamento facendolo scorrere in senso orario.
Impostare una pipetta P1000 su 200 microlitri e inserire la punta nella porta di adescamento. Quindi regolare la pipetta a 230 microlitri mantenendo la punta nella porta di adescamento per disegnare da 20 a 30 microlitri di tampone e rimuovere eventuali bolle d'aria. In un nuovo tubo di reazione a bassa legatura del DNA da 1,5 millilitri, preparare la miscela di adescamento combinando 576 microlitri di tampone RBF con 624 microlitri di acqua libera da nucleasi.
Pipettare con cura 800 microlitri del mix di adescamento preparato nella porta di adescamento e attendere cinque minuti. Successivamente, sollevare il coperchio della porta del campione e pipettare altri 200 microlitri del mix di adescamento preparato nella porta di adescamento. Pipettare 35 microlitri del tampone RBF in un nuovo tubo di reazione pulito a basso legame del DNA da 1,5 millilitri.
Mescolare accuratamente le perline LLB pipettando e aggiungere 25,5 microlitri delle perline al tampone RBF. Successivamente, aggiungere 2,5 microlitri di acqua priva di nucleasi e 12 microlitri di libreria di DNA e mescolare mediante pipettazione. Aggiungere 75 microlitri della miscela campione in modo lento alla cella di flusso attraverso la porta del campione.
Quindi sostituire il coperchio della porta del campione, chiudere la porta di adescamento e chiudere il coperchio del dispositivo di sequenziamento. All'interno del software, verificare che la cella di flusso sia ancora disponibile. Aprire un nuovo esperimento e impostare i parametri di esecuzione selezionando il kit utilizzato.
Selezionare chiamata di base dal vivo. Avviare l'esecuzione del sequenziamento facendo clic su Inizia esperimento. Continuare l'esecuzione del sequenziamento fino a quando non vengono raccolti dati sperimentali sufficienti.
In un esperimento rappresentativo, l'RNA viene estratto da 10 diversi campioni di sangue di cinque specie animali. Le concentrazioni di RNA si osservano tra 43 nanogrammi e 543 nanogrammi per microlitro. Dopo l'amplificazione da parte di RT-PCR, l'analisi gel dei prodotti PCR MPC1 mostra vari risultati con bande marcatamente più deboli per campioni BC01 e BC02.
Queste differenze sono molto probabilmente causate da differenze nella qualità del campione, anche se non si possono escludere differenze nell'efficacia della PCR dovute a differenze nel legame del primer con il gene MCP1 di diverse specie. Tuttavia, queste differenze nella resa e/o nell'efficienza di amplificazione non hanno un impatto significativo sul risultato complessivo del sequenziamento. Un sottoinsieme di 10.000 letture ottenute viene quindi selezionato e demolplexato per ulteriori analisi.
Delle 10.000 letture analizzate, 5.457 mostrano una lunghezza compresa tra 1.750 e 2.000 nucleotidi che corrisponde alle dimensioni previste per i frammenti PCR amplificati come parte del nostro flusso di lavoro. Un ulteriore picco nella distribuzione della lunghezza delle letture si osserva tra 250 e 500 nucleotidi che possono essere attribuiti a prodotti PCR non specifici. La demultiplexing delle letture consente l'assegnazione dell'87,6% delle letture a uno dei 10 campioni analizzati.
Mentre questo metodo è abbastanza affidabile, in condizioni di campo, l'amplificazione PCR è il passaggio più problematico. Durante le nostre esperienze, i protocolli nidificati erano spesso necessari per amplificare le sequenze di destinazione. Oltre a sequenziare i geni ospiti degli animali, questo metodo può anche essere utilizzato per sequenziare qualsiasi DNA o RNA, inclusi agenti patogeni virali o batterici.
Il sequenziamento del nanopore è quindi ora sempre più utilizzato non solo durante i focolai di malattia o per studi scientifici in luoghi remoti, ma anche in laboratori regolari dove le lunghe lunghezze di lettura aprono nuove entusiasmanti possibilità di ricerca. Sebbene nessuno dei reagenti usati sia particolarmente pericoloso, dovrebbero essere seguite le buone pratiche di laboratorio standard. Ovviamente, quando si sequenziano gli agenti della malattia, devono essere osservate tutte le precauzioni necessarie per la manipolazione di questi agenti.
