Questo protocollo è il risultato della valutazione degli aspetti chiave della preparazione della libreria di circRNA, come il tipo di kit, il trattamento RNasi R, le quantità di input e il loro impatto sul rilevamento dell'circRNA. Consente un rilevamento ottimale dell'circRNA e fornisce dati su parametri regolabili a seconda delle esigenze dell'utente. Identificare i circRNA in diversi tipi di campioni ci aiuterà a comprendere meglio la distribuzione della loro espressione e prepara il palcoscenico per delineare il ruolo funzionale di queste molecole.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi campione totale di RNA. È importante mantenere i campioni di RNA sul ghiaccio prima di iniziare il protocollo. Valutare i valori RIN e DV200 sul Bioanalyzer Agilent o su TapeStation prima della preparazione e seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA.
Inizia diluire l'RNA totale a quattro microgrammi in 39 microlitri di acqua priva di RNasi e tubazioni su e giù per mescolare. In un tubo separato, utilizzare 1x RNasi R Buffer per diluire la RNasi R ad una concentrazione di lavoro di due unità per microlitro. Pipetta 39 microlitri di RNA totale e cinque microlitri di 10x RNasi R Reaction Buffer in un tubo di reazione da 1,5 microlitri e mescolare.
Aggiungere sei microlitri della RNasi R.Diluita Quindi regolare la pipetta a pieno volume di reazione e mescolare la soluzione tubazione su e giù 10 volte. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per 10 minuti, assicurandosi che l'intero volume di reazione sia immerso nel bagno d'acqua. Quindi, posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere immediatamente con la pulizia e la concentrazione dell'RNA.
Prima di iniziare, preparare l'RNA Wash Buffer mescolando il concentrato con 48 millilitri di etanolo al 100% e posizionare le colonne di purificazione in tubi di raccolta. Quando è pronto, aggiungere due volumi di RNA Binding Buffer al campione trattato con RNasi R e mescolare bene. Aggiungere 150 microlitri di etanolo al 100% alla miscela per un totale di 300 microlitri, trasferire l'intero volume nella colonna e centrifugare per 30 secondi.
Rimuovere il flusso e aggiungere 400 microlitri di RNA Prep Buffer direttamente alla colonna. Centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso. Quindi, aggiungere 700 microlitri di RNA Wash Buffer alla colonna, centrifugare per 30 secondi e scartare il flusso attraverso.
Aggiungere altri 400 microlitri del Wash Buffer, centrifugare per due minuti e trasferire la colonna in un tubo fresco privo di RNasi da 1,5 millilitri. Aggiungere con cura 11 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente alla colonna tenendo la punta della pipetta proprio sopra il filtro colonna. Lasciare riposare il campione per un minuto a temperatura ambiente, quindi centrifugarlo per un minuto.
Assicurarsi che vi sia flusso nel tubo da 1,5 millilitri e scartare la colonna. Il campione di RNA purificato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente per la preparazione della libreria. Trasferire 10 microlitri dell'RNA totale purificato in un pozzo pulito in una piastra PCR da 96 po'.
Aggiungere cinque microlitri di rRNA Binding Buffer seguiti da cinque microlitri di rRNA Removal Mix, quindi pipettare delicatamente su e giù per mescolare i reagenti. Sigillare la piastra e incubarla per cinque minuti a 68 gradi Celsius su un blocco termociclore preprogrammato e preriscaldato. Dopo l'incubazione, lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.
Rimuovere la guarnizione dalla piastra e aggiungere 35 microlitri di perline di rimozione dell'rRNA a temperatura ambiente vorticose al campione. Regolare la pipetta a 45 microlitri e pipettare su e giù da 10 a 20 volte per mescolare accuratamente. Lasciare riposare il piatto a temperatura ambiente per un minuto.
Trasferire la piastra su un supporto magnetico e incubarla lì per un minuto o fino a quando la soluzione non si sgombrà. Trasferire il supernatante in un nuovo pozzo sul piatto. Quindi trasferire la piastra dal supporto magnetico al supporto della piastra.
Perline di pulizia dell'RNA vortice fino a quando non sono ben disperse e aggiungere 99 microlitri di perline al campione. Pipettare su e giù per mescolare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire la piastra sul supporto magnetico e lasciarla lì per cinque minuti o fino a quando la soluzione non si libera, quindi rimuovere e scartare tutto il supernatante dal pozzo.
Con la piastra ancora sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80% al pozzo senza interrompere le perline. Lasciare l'etanolo nel pozzo per 30 secondi, quindi rimuoverlo e scartarlo. Aggiungere 11 microlitri di Elution Buffer al pozzo e pipettarlo su e giù per mescolare.
Incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti, quindi trasferirla di nuovo sul supporto magnetico e tenerla lì fino a quando la soluzione non si sgombrò. Trasferire 8,5 microlitri del supernatante in un nuovo pozzo sulla stessa piastra e aggiungere 8,5 microlitri di Elute, Primer, Fragment High Mix ad ogni pozzo contenente un campione. Pipettare su e giù 10 volte per mescolare accuratamente, sigillare la piastra e incubarla per otto minuti in un termociclo preriscaldato a 94 gradi Celsius.
Raffreddare il campione a quattro gradi Celsius, rimuovere la piastra dal termociclo e centrifugarla brevemente. Due kit di preparazione della biblioteca, TruSeq e KAPA, sono stati valutati per questo protocollo. Nel complesso, un maggior numero di RNA circolari e una percentuale inferiore di RNA ribosomiale sono stati rilevati quando si utilizza il kit TruSeq, quindi TruSeq è stato selezionato per ulteriori esperimenti.
L'importanza del pretrattamento RNase R è stata valutata confrontando i dati generati da librerie pretrattate e non pretrattate. Come previsto, nelle librerie pretrattate è stato costantemente identificato un numero maggiore di RNA circolari rispetto a quelle non pretrattate. La quantità di RNA di ingresso è stata ottimizzata per rilevare una maggiore diversità di RNA circolari.
Le librerie erano preparate usando uno, due e quattro microgrammi di RNA in ingresso, e la più alta diversità di specie di RNA circolari è stata osservata quando si usano quattro microgrammi di RNA totale. Il protocollo ottimizzato è stato utilizzato per confrontare l'abbondanza di RNA circolare in cinque regioni cerebrali da quattro donatori sani e per altri tipi di tessuti da sei donatori sani. Nel complesso, una maggiore abbondanza di RNasi circolare è stata osservata nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.
È importante ricordare di seguire le procedure appropriate quando si lavora con l'RNA, incluso indossare guanti, pulire accuratamente la panca e le pipette con salviette o spray RNasi prima di iniziare il protocollo e mantenere l'RNA sul ghiaccio in anticipo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire la convalida ortogonale come il sequenziamento Sanger delle giunzioni di circRNA identificate. La scoperta di nuovi circRNA e un'ulteriore prova della loro presenza ritagliano una nuova area di ricerca per esplorare le loro funzioni biologiche.
