L'angiogenesi gioca un ruolo importante nella metastasi e nella progressione tumorale. In questo protocollo, useremo il doppio metodo di imaging della bioluminescenza per monitorare la progressione dinamica del tumore e l'angiogenesi in un modello di topo di cancro al seno. In questo modello, possiamo monitorare la crescita tumorale e l'angiogenesi contemporaneamente nel singolo topo attraverso l'imaging luciferasi firefly e renilla luciferasi, rispettivamente.
Questo modello può essere ampiamente applicato nello screening antitumore e nella ricerca oncologica. Questo modello di doppia bioluminescenza può essere utilizzato per tracciare la progressione e la regressione tumorale e per rilevare i processi molecolari correlati al tumore in risposta alle strategie terapeutiche. L'angiogenesi è un processo cruciale di progressione tumorale.
Pertanto, il monitoraggio della progressione del tumore e dell'angiogenesi in modo visivo e sensibile è necessario per sviluppare trattamenti tumorali efficaci. Le procedure saranno dimostrate da Kaiyue Zhang, Chen Wang e Shang Chen, studenti del nostro laboratorio. Per il confezionamento del lentivirus e i semi di produzione uno per 10 al sesto di 293T cellule in due millilitri di DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% per pozzo in una piastra a sei porri per la coltura notturna in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
La mattina seguente mescolare 7,5 microlitri di liposoma con 250 microlitri di Minimal Essential Medium in due tubi separati da 1,5 millilitri per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Per preparare le soluzioni di DNA aggiungere il vettore RR del lentivirus plasmide e i plasmidi aiutanti a 250 microlitri di Minimal Essential Medium in singoli tubi da 1,5 millilitri come delineato nella tabella. Al termine dell'incubazione aggiungere delicatamente le soluzioni di DNA RR alle sospensioni liposomiche in modo drop-wise e lasciare che il DNA si lega alle membrane lipidiche per 20 minuti a temperatura ambiente.
Mentre la miscela è in incubazione, sostituire il supernatante della coltura cellulare 293T con un millilitro di mezzo di coltura fresco e aggiungere delicatamente 0,5 millilitri della miscela di DNA liposoma appropriata ad ogni pozzo. Riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per 12-16 ore prima di sostituire il supernatante in ogni pozzo con un millilitro di mezzo di coltura fresco integrato con antibiotici. Dopo altre 36 ore di incubazione, mettere in comune i supernaganti in un tubo conico per ceppo di lentivirus per sedimentare le cellule 293T mediante centrifugazione.
Quindi trasferire i supernaganti contenenti lentivirus RR in singoli tubi di stoccaggio in polipropilene sterile da 1,5 millilitri per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Per la trasduzione lentivirale per l'espressione genica nelle cellule tumorali mammarie 4T1, sostituire il supernatante in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare 4T1 a sei pozzetto con un millilitro di mezzo di coltura cellulare fresco a base di RPMI integrato con siero bovino fetale e un millilitro di stock lentivirale. Quindi aggiungere otto microgrammi per millilitro di Polibrene a ciascun pozzo e pipettare delicatamente alcune volte per mescolare.
Centrifugare la piastra per aumentare l'efficienza di trasduzione e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per quattro o 12 ore. Al termine dell'incubazione, sostituire il supernatante in ogni pozzo con un mezzo di coltura fresco integrato con siero e antibiotici per rimuovere eventuali particelle lentivirali e Polibrene. Per selezionare le cellule trasdutite da lentivirus, passare le colture cellulari 4T1 trasdotto con un rapporto uno-tre a uno-quattro con mezzo di selezione, cambiando il mezzo ogni due o tre giorni.
Dopo sette giorni di coltura media di selezione, visualizzare le colture cellulari trasdotto sotto un microscopio a contrasto di fase invertito a fluorescenza e contare il numero di cellule rosso fluorescenti positive o RFP-4T1 e tutte le cellule 4T1 in tre campi visivi per stimare il rapporto RFP-positivo. Per impostare un modello di topo portante di tumore, lavare le colture cellulari trasdutte confluente all'80% con PBS prima di staccare le cellule con due millilitri di tripside-EDTA per piastra di coltura di 60 millimetri. Quando le cellule si sono alzate dai fondi della piastra fermare la reazione con da cinque a 10 millilitri di siero integrato mezzo per piastra.
E trasferire le colture in singoli tubi di centrifuga da 15 millilitri per il conteggio. Diluire le cellule a una per 10-sesta cellule per 100 microlitri di mezzo di coltura senza concentrazione siere. E iniettare per via sottocutanea 100 microlitri della linea cellulare 4T1-RR nella spalla sinistra di un topo modello anestetizzato che porta tumore, e 100 microlitri della linea cellulare 4T1-RRT nella spalla destra dello stesso mouse.
Dopo le iniezioni, posizionare ogni mouse in un'area di recupero appropriata con un supporto termico fino a completo recupero. Palpare le masse tumorali ogni giorno per sette giorni per confermare che i topi sono portanti di tumore. Al settimo giorno dopo l'impianto, iniettare per via intraperitoneale 50 microgrammi per chilogrammo di Ganciclovir in ogni topo portante di tumore due volte al giorno fino alla fine dell'esperimento.
Per la crescita tumorale, aprire il Living Imaging System. Inizializzare il software Living Imaging e inizializzare il sistema. Durante l'inizializzazione del sistema, utilizzare una siringa per insulina per iniettare ogni mouse da immagini con il volume appropriato di coelenterazina nella retrobulbar.
Posizionare i topi iniettati nella camera della fotocamera e ottenere immediatamente diverse immagini del mouse dorsalmente per acquisire i segnali di Renilla luciferasi dalle cellule 4T1 fino a quando i segnali bioluminescenti svaniscono. 10 minuti dopo l'imaging della renilla luciferasi, utilizzare una siringa per insulina per iniettare per via intraperitoneale il volume appropriato di D-luciferina in ogni animale. 10 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina, posizionare i topi nella camera della fotocamera e ottenere diverse immagini della dorsale del mouse per acquisire i segnali di luciferasi firefly dall'angiogenesi.
Dopo la trasduzione del lentivirus, più del 99% delle cellule sono positive alla RFP senza differenze nella morfologia della coltura cellulare osservata tra le due linee cellulari trasdotto. Successivamente, l'imaging a bioluminescenza delle cellule trasdutte rivela che entrambe le linee cellulari emettono forti segnali bioluminescenti di una forza simile. Dopo l'iniezione sottocutanea delle linee cellulari trasdutte in un modello di topo trasgenico che porta tumore, la crescita tumorale indotta dall'angiogenesi può essere valutata dai segnali luciferasi firefly in presenza di D-luciferina nello stesso animale.
A sette giorni dal post-impianto, la somministrazione di Ganciclovir induce la morte nelle cellule 4T1-RRT con conseguente drastica riduzione del segnale di Renilla luciferasi nei tumori stabiliti da queste cellule. Anche i segnali della lucciola luciferasi aumentano in concomitanza con un aumento dell'espressione della renilla luciferasi e diminuiscono a seguito del declino della luciferasi. Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che esiste una correlazione diretta tra angiogenesi tumorale e crescita tumorale.
Infatti, la morte cellulare tumorale indotta da Ganciclovir può portare a un'inibizione dell'angiogenesi tumorale. Inoltre, l'immunostaining per il recettore del fattore di crescita endoteliale anti-vascolare II, come marcatore di angiogenesi, rivela una struttura microvascolare più significativamente stabilita nelle sezioni del tessuto tumorale 4T1-RR rispetto alle sezioni dei tumori 4T1-RRT, coerentemente con il declino del segnale luciferasi Firefly osservato dopo la somministrazione di Ganciclovir. Il passaggio più critico del protocollo è l'utilizzo di due tipi di luciferasi, come FLuc e RLuc per il tracciamento simultaneo delle cellule e l'angiogenesi.
Questa tecnologia potrebbe essere utilizzata per trattare le cellule tumorali in luoghi diversi, e può essere ampiamente utilizzata nei modelli di cancro al virus. Questo modello di topo consente di visualizzare dinamicamente la crescita tumorale e gli effetti antitumorali del sistema di tracciamento HSV-ttk/GCV in un animale vivente. Una struttura di livello II di biosicurezza è necessaria per prevenire una trasfezione del lentivirus, poiché il supporto contiene particelle di lentivirus che potrebbero essere dannose per l'uomo.
