Questo protocollo genera dati di trascrizione ad alta velocità effettiva delle singole cellule isolotti umane, che possono essere utilizzati per studiare l'eterogeneità delle cellule anocrome, identificare il tipo di cellule rare e la regolazione genica nelle malattie. Questa tecnica genera dati a cella singola su larga scala, è facile da usare e ha tempi di elaborazione abbastanza brevi. Questo metodo può essere applicato agli isolotti di altre specie e per profilare altri tessuti appena isolati.
Tuttavia, il protocollo deve essere ottimizzato per adattarsi alle procedure di dissociazione specifiche dei tessuti. È fondamentale preparare cellule dissociate di alta qualità. Qc della sospensione cellulare prima del partizionamento a cella singola è fondamentale, così come la gestione dell'emulsione con attenzione e rapidità.
Alcuni checkpoint di qualità come sapere se un chip si è intasato sono meglio visti che letti. Dopo aver ottenuto isolotti umani e aver incubato durante la notte, contare e fare un passo da 200 a 300 isolotti utilizzando una pipetta P200. Trasferire gli isolotti in un tubo conico di 15 millimetri contenente cinque millimetri di supporto isolotto completo, preri warmed a 37 gradi Celsius.
Posizionare il tubo in una centrifuga a 200 volte G per due minuti. Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare il pellet sul fondo. Aggiungere un millimetro di soluzione di dissociazione cellulare pre-riscaldata e interrompere il pellet tubazione delicatamente su e giù.
Incubare gli isolotti a 37 gradi Celsius per nove-11 minuti. Ogni tre minuti, pipettare lentamente su e giù per 10 secondi per dissociare le cellule in singole cellule. Una volta che le cellule dell'isolotto sono ben dissociate e la soluzione diventa torbosa, aggiungere nove millilitri di mezzi isolotti completi e filtrare attraverso un filtro cellulare da 30 micrometri in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Raccogliere le cellule per centrifugazione a 400 volte G per cinque minuti. Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 200-300 microlitri di soluzione 1X PBS 04%BSA. Ora, mescolare 10 microlitri della coltura cellulare con 0,5 microlitri di AO/DAPI.
Pipetta su e giù per mescolare accuratamente. Caricare 10,5 microlitri su una diapositiva ed eseguire il test del conteggio delle celle su un contatore di celle automatizzato basato sulla fluorescenza per determinare il conteggio e la vitalità. Posizionare un chip microfluidico in una custodia per chip.
Orientare la custodia del truciolo, assicurando che i pozzi petroliferi siano più vicini alla persona che esegue l'esperimento. Utilizzare una pipetta per aggiungere il volume calcolato di celle nelle strisce di tubo preparate. Pipetta da mescolare cinque volte.
Senza scartare le punte delle pipette, trasferire 90 microlitri di miscela cellulare per remare uno dei chip. Attendere 30 secondi, quindi pipettare molto lentamente per caricare 40 microlitri di perline di gel per remare due. Distribuire 270 microlitri di olio divisorio ai pozzi della terza fila.
Agganciare la guarnizione del truciolo alle linguette del supporto del truciolo. Posizionare il supporto del chip assemblato nel dispositivo di partizionamento a cella singola e premere il pulsante esegui. Al termine della corsa, rimuovere la guarnizione del truciolo dal supporto, aprire la custodia del truciolo con un angolo di 45 gradi e trasferire 100 microlitri dell'emulsione dal chip in un pozzo in una piastra di plastica blu da 65 poggia.
Erogare 125 microlitri di emulsione rosa rompendo il reagente in ogni emulsione. Attendere un minuto, quindi trasferire l'intero volume di ogni pozzo in ogni tubo da 0,2 millilitri. Assicurarsi che vi sia uno strato di trasparente e uno strato di rosa nella striscia del tubo.
Con una pipetta, rimuovere 125 microlitri dello strato rosa dal fondo della striscia del tubo senza disturbare lo strato trasparente. È normale che un piccolo volume di circa 15 microlitri dello strato rosa rimanga nel tubo. Quindi aggiungere 200 microlitri di miscela di pulizia a ciascuna delle strisce del tubo e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
Trasferire le strisce del tubo su un supporto magnetico e attendere due minuti per consentire alla soluzione di sgombro. Rimuovere il supernatante e scartare. Quindi lavare le perline con l'80% di etanolo due volte.
Lasciare asciugare le perline per un minuto. Rimuovere le strisce del tubo dal magnete e aggiungere 35,5 microlitri di soluzione di eluizione alle perline. Pipetta per sospendere di nuovo le perline nella soluzione e incubare per due minuti a temperatura ambiente.
Trasferire le strisce del tubo su un supporto magnetico e lasciare che la soluzione si sgombri. Trasferire il DNA complementare purificato dalle strisce del tubo per pulire strisce di tubi da 0,2 millilitri. Per amplificare il DNA complementare, aggiungere prima 65 microlitri di mix di master di amplificazione del DNA complementare ad ogni campione.
Posizionare le strisce del tubo in un termociclo e eseguire il programma in base al manoscritto. I campioni possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di 72 ore. Dopo aver normalizzante il DNA complementare a 15 anagrammi e 20 microlitri, aliquote 30 microlitri di miscela di tagmentazione ad ogni campione di DNA complementare sul ghiaccio.
Mettere i campioni nel termociclo ed eseguire il protocollo di tagmentazione a 55 gradi Celsius per cinque minuti, diminuendo a 10 gradi Celsius e tenere premuto. Aggiungere quindi 60 microlitri di PCR Master Mix a indice campione e 10 microlitri di indice del campione di forolegolo 20 micromolare al campione di DNA complementare purificato a 30 microlitri. Restituire i tubi al termociclo per amplificare il prodotto della libreria finale.
Normalizzare ogni campione con acqua a due nanogrammi per microlitro e tirare insieme tre microlitri di ogni campione normalizzato in un tubo da 1,5 millilitri. Diluire il pool con tampone di eluizione a 0,25 nanogrammi per microlitro. Denaturare la piscina combinando 12 microlitri del campione di piscina diluito, un microlitro di un animale o controllo del DNA, due microlitri di tampone di eluizione e cinque microlitri di idrossido di sodio normale 0,4.
Incubare la miscela per cinque minuti, quindi aggiungere 10 microlitri di Tris da 200 millimolari a pH8 e caricare 4,05 microlitri della miscela in 1345,95 microlitri di HTA-1. Successivamente, caricare 1,3 millilitri nella cartuccia del sequencer ed eseguire secondo le linee guida del produttore utilizzando una ricetta di sequenziamento. Nel computer eseguire Ranger celle per de-multiplex file di chiamata di base non elaborati generati sequenziando in file FASTQ.
Allineare i file FASTQ all'assemblaggio del genoma umano b37.3 e utilizzare il modello genico CSC per ottenere la quantificazione dell'espressione. Esaminare il grafico a barre per assicurarsi della separazione dei codici a barre associati alla cella e dello sfondo. Per controllare la qualità delle cellule, escludere le cellule con meno di 500 geni rilevati, meno di 3.000 identificatori molecolari univoci e un punteggio di vitalità superiore a 0,2.
Regolare i cut-off in base ai tipi di tessuto e cellule. Successivamente, utilizzare R pacchetto mclust per rimuovere le cellule che esprimono più di un gene ormonale. Usa il seurat del pacchetto R per normalizzare l'espressione genica per gli identificatori molecolari univoci totali e moltiplicare per un fattore di scala di 10.000 a livello cellulare.
Quindi rilevare geni variabili usando l'espressione media e la dispersione di tutte le cellule. Regolare i cut-off in base al tessuto e ai tipi di cellule. Eseguire l'analisi dei componenti principali con i geni variabili.
Celle cluster con un numero selezionato di componenti principali. Derivare geni arricchiti da cluster cellulari confrontando un ammasso cellulare con il resto delle cellule. In questo protocollo di sequenziamento dell'RNA a singola cella, gli isolotti umani acquisiti sono stati prima dissociati come convalidati dalle cellule alfa e beta nella fluorescenza dell'RNA e nell'ibridazione C2.
Un esempio riuscito di emulsione dopo il passaggio di partizionamento mostra una soluzione uniforme pallida e torbosa con olio divisorio minimo separato dalle perline di gel. Al contrario, un'emulsione di scarsa qualità con separazione di fase chiara tra le perline di gel e l'olio potrebbe essere dovuta a un intasamento durante il run del truciolo. Dopo l'amplificazione complementare del DNA, una distribuzione rappresentativa delle dimensioni di un frammento mostra il picco tipico per un campione di DNA complementare di buona qualità residente vicino a 1.000-2.000 coppie di basi.
Il picco vicino a 600 coppie di basi era specifico del DNA complementare all'isolotto. La distribuzione delle dimensioni di un frammento per le librerie di sequenziamento dell'RNA era compresa tra 300 e 500 coppie di basi. L'analisi del clustering ha rivelato 12 tipi di cellule nello spazio delle dimensioni stocastico di incorporamento del vicino stocastico distribuito a T.
Sono state rivelate tre sotto-popolazioni in cellule alfa e quattro in cellule beta. Questa tecnica consente ai ricercatori di costruire isolotti cellulari completi per isolotti umani. Con più dati da donatori non diabetici e diabetici, viene utilizzato per le risorse per la scoperta di target terapeutici.
