Questo protocollo è adatto per la produzione di diterpenoidi purificati che possono essere utilizzati per diverse analisi a valle e possono essere personalizzati per una gamma di diversi bersagli metaboliti. Il vantaggio principale di questo metodo è che è un metodo semplice ed economico per produrre quantità di milligrammi di metaboliti specializzati. Scambiando i geni e gli enzimi utilizzati per la co-espressione, questo metodo può essere modificato per produrre altri terpenoidi, inclusi monoterpenoidi e sesquiterpenoidi, così come altre classi di metaboliti come i flavonoidi.
Per la produzione e la trasformazione metabolica diterpenoide, iniziare riscaldando le cellule E.coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Quando la coltura si è scongelata, aggiungere 25 microlitri di cellule competenti per costrutto a un microtubo refrigerato da 1,5 millilitri e aggiungere 1 microlitro di una soluzione di 100 nanogrammi per microlitro di ogni costrutto utilizzato per la co-espressione. Incubare le miscele sul ghiaccio per 30 minuti con miscelazione delicata ogni 10 minuti raschiando i tubi attraverso un rack di microtubi.
Alla fine dell'incubazione, scaldare le miscele cellulari a 42 gradi Celsius per un minuto prima di riposizionare le cellule sul ghiaccio per almeno altri due minuti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di 37 gradi Celsius SOC medio ai tubi. E incubare le colture per un'ora a 37 gradi celsius e 200 rotazioni al minuto.
Al termine dell'incubazione, aggiungere circa 10 perline di vetro autoclavato e 100 microlitri di cellule a una piastra di agar di brodo di lisogenia riscaldata di 37 gradi Celsius con gli antibiotici appropriati. E agitare la piastra orizzontalmente con il coperchio in posizione per distribuire uniformemente le cellule. Quindi, toccare delicatamente le perline di vetro in un contenitore di rifiuti e incubare la piastra a 37 gradi celsius durante la notte, lato superficiale rivestito verso il basso.
Il giorno dopo, rimuovere la piastra dall'incubatore. Aggiungere 5 millilitri di brodo di lisogenia appena preparato con gli antibiotici appropriati a un tubo di vetro sterile da 15 millilitri con un tappo traspirante in plastica per coltura pianificata da 1 litro e utilizzare una punta di pipetta per raccogliere singole colonie di E.Coli trasformate dalla piastra di agar. Aggiungere una colonia raccolta a ciascuno dei tubi da 15 millilitri preparati e cappucciare ogni tubo con il cappuccio di plastica traspirante di accompagnamento.
Quindi, posizionare le piccole colture E.coli con il chiuso in un incubatore di scuotimento di 37 gradi Celsius per 12-24 ore. Il giorno dopo aggiungere 100 millilitri di 10x PBS a 900 millilitri di brodo formidabile in un pallone da 1 litro per piccola coltura con gli antibiotici appropriati. E posizionare i contenitori a 37 gradi Celsius e 140 rotazioni al minuto per circa 30 minuti.
Quando il brodo formidabile è caldo, aggiungere l'intero volume di 5 millilitri di ogni coltura di inoculazione a un pallone da coltura da 1 litro per coltura. E posizionare i contenitori nell'incubatrice di scuotimento a 140 rotazioni al minuto per circa 3 ore. Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,6, ridurre la temperatura dell'incubatore a 16 gradi Celsius.
Una volta raffreddato l'incubatore, aggiungere 1 millilitro di un IPTG molare, 1 millilitro di 4 grammi per litro di riboflavina appena preparato e 1 millilitro di acido amminolevulinico appena preparato 150 grammi per litro ad ogni coltura. Per la produzione di diterpenoidi, aggiungere 25 millilitri di un piruvato di sodio molare ad ogni coltura per garantire una formazione precursore sufficiente. Quindi, incubare le colture a 16 gradi Celsius e 140 rotazioni al minuto per 72 ore, aggiungendo 25 millilitri di piruvato di sodio al giorno alle colture appropriate.
Per la separazione e la purificazione dei metaboliti, fissare un imbuto separatore su un supporto ad anello in una cappa aspirante. E metti un contenitore di rifiuti sotto l'imbuto. Versare 500 millilitri di una soluzione 50/50 di acetato di etile ed esaani nell'imbuto separatore.
E aggiungere 500 millilitri della cultura di co-espressione trasformata di E.coli di interesse nell'imbuto. Posizionare il tappo di vetro sull'imbuto e agitare l'imbuto da 5 a 10 volte per mescolare la coltura con il solvente di estrazione, aprendo frequentemente il rubinetto mentre l'imbuto è capovolto e puntarlo nella cappa dei fumi per degasare l'imbuto. Dopo un secondo giro di scuotimenti e degassamenti come appena dimostrato, posizionare l'imbuto in posizione verticale sul supporto dell'anello per circa un minuto.
Quando lo strato superiore del solvente si è separato dallo strato di coltura acquosa, rimuovere il tappo e drenare lo strato di E.coli in un becher di scarto, mantenendo lo strato di solvente all'interno dell'imbuto. Quindi, ripetere l'estrazione con i restanti 500 millilitri della coltura utilizzando gli stessi 500 millilitri di solvente utilizzati per la prima estrazione, prima di drenare il solvente contenente i metaboliti estratti in un pallone pulito. Qui viene mostrato il nostro cromatogramma rappresentativo gascromatografia-spettrometria di massa dei tipici prodotti enzimatici estratti.
I sottoprodotti minori comunemente osservati includono il cloramfenicolo e i derivati dell'indolo oxindole e indole pivalaldehyde. Dopo la purificazione del diterpenoide attraverso la cromatografia a colonna di silice, è possibile ottenere tre composti di dolabralexina, quantificati sulla base di una curva standard utilizzando lo sclareolo diterpenoide. La cromatografia silice è ideale per ottenere un'elevata purezza dei composti bersaglio.
Poiché consente la semplice preparazione di olefine diterpene e derivati ossigenati e rimuove prontamente l'oxindolo contaminante maggiore, che viene trattenuto sulla matrice di silice. Inoltre, la co-espressione dei geni della via terpenoide può essere usata per produrre diterpenoidi in N.Benthamiana, con conseguente produzione di dolabradiene e 15, 16 epossidolabrene. I solventi utilizzati durante l'estrazione devono essere ottimizzati per le proprietà chimiche fisiche dei metaboliti di interesse e non devono essere miscelabili con acqua per mantenere due strati distinti.
Seguendo questa procedura, i metaboliti purificati possono essere utilizzati per l'analisi a valle, comprese le analisi strutturali e gli acidi antibiotici. Questa tecnica ha permesso la scoperta di nuovi diterpenoidi, compresi quelli mostrati qui, permettendo a questi metaboliti di essere analizzati per la loro struttura chimica e nuove biattività. Prendere precauzioni quando si utilizzano solventi organici in un imbuto separatore.
Assicurati sempre di smaltire i rifiuti biologici secondo i tuoi standard di sicurezza di laboratorio.
