Name: laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
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The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

Nota: un adeguato mammiferi vettore di espressione deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui, viene utilizzato un singolo costrutto contenente due cassette di espressione (cioè espressione catena pesante e leggera è guidato dai promotori separate). Trastuzumab catene pesanti e leggere sono stati precedentemente clonati nel vettore. Questo vettore è stato un regalo da Andrew Beavil, ottenuta attraverso un repository plasmide profitto non-per-13. 1. Il recupero e scale-up di vettore DNA NOTA: Vector DNA è stato ricevuto come una cultura pugnalata soft agar in Escherichia coli XL-1 Blue ceppo; vettore trasporta resistenza Hygromycin. <ol><li> Inserire una pugnalata inoculo sterile o ad anello in agar morbido della cultura coltellata poi si depositano su una Luria Bertani (LB) piastra di agar preparata con 75 mg / ml Hygromycin per colonie isolate. Incubare la piastra a 37 ° C per 18-24 ore. </li><li> Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo Terrific (TB) contenente 75 mg / ml Hygromycin. Incubate la cultura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li><li> Utilizzare la cultura durante la notte per preparare uno stock di glicerolo di DNA vettore mescolando delicatamente 800 ml di cultura con 200 ml 80% glicerolo in una provetta Microbank ™ e congelamento a -80 ° C. <ol><li> Aggiungere 100 ml di coltura durante la notte a 100 ml TB contenente 75 ug / ml in un pallone Hygromycin agitatore confuso (cioè 1 / 1.000 diluizione). Incubare la coltura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li></ol></li><li> Dopo cultura durante la notte, estrarre e purificare il DNA in base alle istruzioni del kit di preparazione midi / maxi con la seguente eccezione del fabbricante; durante la fase, eluire o risospendere finale del DNA con acqua (pH 7,0-8,5). </li><li> Controllare la concentrazione e la purezza di DNA da letture di assorbanza a 260 e 280 nm quindi memorizzare DNA a -20 ° C. NOTA: opzionale (altamente consigliato): la sequenza DNA utilizzando primer specifici vettore per confermare l&#39;identità. </li></ol> 2. Trasfezione stabile di cellule HEK-293 <ol><li> Crescere e mantenere HEK-293 cellule (cellule sospensioni) secondo protocolli standard in mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici in beute. Mantenere a 2 x 10 5 cellule / ml e sottocultura ogni quarto giorno. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. NOTA: Le cellule avrebbero dovuto essere in coltura per non meno di 4 giorni e non più di 4 settimane prima della trasfezione. HEK-293 cellule cresciute in monostrati in mezzi di siero contenenti possono anche essere utilizzati per questa procedura. </li><li> Il giorno prima della trasfezione, seme cellule HEK-293 a 3 x 10 5 cellule / ml in pozzetti di una piastra 12 pozzetti in 2 ml di Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) supplementato con siero fetale bovino inattivato al calore 10% ( FBS). Il giorno della trasfezione, controllare che le cellule hanno raggiunto 80-90% di confluenza </li><li> Diluire il DNA e polietilenimmina (PEI) separatamente nel supporto di transfezione poi mescolare insieme.<ol><li> Diluire 1,25 mg vettore DNA per bene (15 mg per 12 pozzi) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Diluire 2,5 ml di 1 mg / ml soluzione PEI (30 microlitri per 12 pozzi, cioè rapporto 1: 2 del DNA a PEI) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere DNA diluito al diluito PEI, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml di DNA / PEI miscela goccia a goccia a ciascun pozzetto della piastra. Oscillare delicatamente la piastra per distribuire la miscela di trasfezione quindi posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. </li><li> Aggiungere 50 ug / ml Hygromycin B per pozzetto e riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 giorni. NOTA: Giorno 10, le cellule non-trasfettate saranno morte e distaccata dalla superficie della piastra, mentre le cellule stabilmente transfettate saranno vitale e attaccato alla piastra. </li><li> Sostituire i supporti in pozzi con1/4 media liberi-siero volume e 3/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 0,5 ml mezzi privi di siero + 1,5 ml DMEM = 7,5% concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 1/2 mezzi privi di siero volume e 1/2 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè mezzi privi di siero 1 ml + 1 ml di DMEM = concentrazione sierica finale 5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 3/4 mezzi privi di siero volume e 1/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 1,5 ml mezzi privi di siero + 0,5 ml DMEM = concentrazione sierica di finale 2,5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 2 ml di mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici (cioè concentrazione sierica di finale 0%) e incubare per 4 giorni. NOTA: Mantenere 50 mg / igromicina B pressione selettiva ml su cellule durante l&#39;adattamento privo di siero. Le cellule adattate ai mezzi privi di siero si staccano dalla superficie dei pozzi e possono raggruppare iSospensione n. Fare riferimento al punto 2.1 per condizioni di coltura con il supplemento aggiuntivo di 50 mg / ml igromicina B. </li><li> Usando una pipetta, delicatamente mescolare le colture in sospensione nelle cellule piastra e piscina da 12 pozzetti in un tubo separato. <ol><li> Utilizzando un emocitometro, enumerare cellule pool e sementi in 30 ml mezzi privo di siero in una beuta a 2 x 10 5 cellule / ml. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. Subculture ed espandere ogni quarto giorno. </li></ol></li><li> Continuare a espandere dimensioni coltura a densità cellulare richiesto per ottenere 10 fiale a 1 x 10 7 cellule / fiale per la crioconservazione in azoto liquido. Congelare le cellule in mezzi privi di siero contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO). NOTA: condizionata supporti contenenti anticorpi possono essere raccolte ad ogni sottocultura di confermare la produzione di proteine ​​o utilizzati per ottimizzare le condizioni di purificazione. Per raccogliere i media condizionata e mantenere le cellule di sottocultura, centrifugare la coltura a300 xg per 5 minuti poi filtrare-sterilizzare surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron. surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C per 1-2 settimane o -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. Large Scale produzione di anticorpi da lotto Erbaiuto Cultura NOTA: La produzione di anticorpi può essere seguita su dal punto 2.11 dove le cellule esistenti vengono espanse per la densità cellulare desiderato in base al volume della cultura overgrow batch per essere messa a punto. Altrimenti, le cellule che sono stati scongelati da crioconservazione iniziano in questa fase, una volta espanso ad una densità cellulare appropriata e volume. Vari supplementi di coltura possono essere utilizzate per ottimizzare la produzione di anticorpi; l&#39;uso di triptone per aumentare la resa degli anticorpi è dimostrato in questo protocollo. <ol><li> Cellule Seed a 2 x 10 5 cellule / ml in 100 ml di mezzi senza siero in due beute (per confrontare i rendimenti di anticorpi provenienti da culture non-integrato e nutrienti integrazioni). Culture a 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt; e 120 giri al minuto. </li><li> Dopo 24 ore, aggiungere triptone ad una concentrazione finale di 0,5% alla cultura nutrienti integrato. Pareggiare il volume della cultura non-integrato con mezzi senza siero. </li><li> Dal giorno 8, eseguire la conta delle cellule delle culture quotidiane utilizzando un emocitometro per monitorare la vitalità cellulare. Raccogliere le sovranatanti una volta la vitalità cellulare è inferiore al 80%. <ol><li> Harvest surnatante mediante centrifugazione delle colture a 3.000 xg per 15 min quindi filtrata-sterilizzare il surnatante (contenente anticorpi) attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare il surnatante a 4 ° C (a breve termine) o congelare a -20 ° C (a lungo termine). </li></ol></li></ol> 4. Anticorpo Purificazione per affinità e cromatografia utilizzo di un cromatografia liquida automatica veloce Protein (FPLC) Sistema NOTA: La seguente procedura può essere generalmente applicata a sistemi più automatizzati. La purificazione può essere eseguita a temperatura ambiente oa 4 ° C (se il sistema FPLC è conservato in una camera fredda).Una serie di test di scouting può essere eseguita per individuare le condizioni ottimali di depurazione tra cui matrice colonna appropriata, tampone, tampone di eluizione e pH vincolante per garantire il massimo recupero di anticorpo purificato dai media condizionati (fare riferimento alla sezione Risultati). Le condizioni ottimali dipendono anticorpi o proteine ​​di essere purificati. Purificazioni sono stati eseguiti su un sistema FPLC automatizzato. Purificazioni state eseguite a temperatura ambiente usando una proteina 5 ml Una colonna. <ol><li> Preparare i seguenti tamponi con acqua ultrapura e regolare il pH consigliato poi filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. <ol><li> Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4 (tampone di legame) mescolando il seguente: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 e 0,001 M KH 2 PO 4. Aggiustare il pH se necessario prima di filtrare il buffer. </li><li> Preparare 500 ml di 0,1 M glicina-HCl pH 2.7 (tampone di eluizione). Regolare il pH prima di filtrare il buffER. </li><li> Preparare 50 ml di 1 M Tris pH (tampone di neutralizzazione) 9.0. </li></ol></li><li> Assicurarsi che tutti i collegamenti di alimentazione e di comunicazione del sistema con il computer sono fatti. I dispositivi devono essere visibili nel modulo &#39;di controllo del sistema&#39; software. Assicurarsi cella UV è impostata a 280 nm di lunghezza d&#39;onda. Opzionale: Calibrare pH-metro se collegato e da utilizzare. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura per lavare il sistema. Spurgare le pompe con una siringa se c&#39;è aria nella tubazione o sospetto di aria nel sistema. Lavare il sistema con acqua mediante operazione manuale tramite il controllore di sistema o tramite un metodo automatizzato. Si osservi che la pressione, conducibilità, tracciamento UV280 e pH rimane costante e che il limite di pressione per la colonna non sia superato secondo le specifiche del produttore. NOTA: Le anomalie possono indicare l&#39;aria o il blocco del sistema che dovrebbe essere affrontato prima di procedere. </li><li> Nel modulo di controllo del sistema, avviare la portata a 1ml / min manualmente tramite pompa A sia carico (bypassando loop del campione) o iniezione (attraverso il campione loop) grado di iniziare a collegare la colonna. tubing sistema Disconnect all&#39;ingresso posizione di colonna e rimuovere il tappo collegato all&#39;ingresso colonna. <ol><li> Permettere all&#39;acqua di fluire dal tubo a gocce sistema superiore della colonna quindi fissare il tubo di sistema alla colonna. Avendo l&#39;ingresso della colonna e raccordo di ingresso traboccante di gocce d&#39;acqua garantisce un collegamento privo di bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Collegare l&#39;uscita della colonna in uscita a valle e verificare tutti i raccordi siano ben fissati. Con la colonna ora collegata al sistema, non superare i limiti di massima pressione e portata come descritto nelle specifiche di colonna. </li><li> Lavare colonna con 5 volumi di colonna (CV) di acqua. Se necessario, continuare a lavare colonna fino a UV280 tracciato si è stabilizzata. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A in Binding Buffer, B in tampone di eluizione e pompa di campionamento in Binding Buffer to riequilibrare il sistema nei buffer corrette. Riempire i tubi di ingresso con il tampone usando PumpWash per il funzionamento manuale. </li><li> Nel modulo del software &#39;Method Editor&#39;, utilizzare il metodo guidata per impostare un metodo di cromatografia di affinità per la colonna che è destinato ad essere utilizzato. NOTA: e sistemi automatizzati di FPLC sono dotati di metodi di pre-riempita con le impostazioni consigliate (cioè della portata e della pressione limite) ed eseguire operazioni in base alla colonna (produttore, matrice e dimensione) selezionati per la purificazione. <ol><li> Utilizzare i seguenti passi di esecuzione per proteina A cromatografia di affinità: <ol><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li><li> campione di carico nella colonna (volume da caricare viene specificato manualmente nel metodo) e raccogliere eluato in un contenitore separato. </li><li> Sistema di lavaggio con 5 CV di tampone Binding raccogli eluato in un contenitore separato. </li><li> colonna eluire con 5 CV isocratic frazionamento con tampone di eluizione e raccogliere campioni anticorpo purificato come frazioni di raccoglitore di frazioni. </li><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li></ol></li></ol></li><li> Una volta che il metodo è stato impostato, specificare il volume di mezzi condizionati da applicare alla colonna e salvare il metodo. NOTA: Il volume specificato nel metodo dovrebbe essere 5-10 ml inferiore al volume reale per evitare l&#39;introduzione di aria durante la corsa del campione. Il volume specificato utilizzato in questo protocollo è 90-120 ml. </li><li> Immergere il tubo della pompa campione nel recipiente contenente il supporto condizionata. </li><li> Preparare un contenitore separato per raccogliere eluato campione attraverso il tubo di uscita specificato. NOTA: E &#39;importante raccogliere l&#39;eluato, nel caso si verifichi un errore durante la corsa o la capacità di legame della colonna viene superata richiede l&#39;eluato per essere riapplicata alla colonna o la purificazione repeated. </li><li> Preparare tubi di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Aggiungere 100 ml di tampone di neutralizzazione per 1 ml volume della frazione. Il sistema FPLC si eluire automaticamente le frazioni nei tubi di raccolta. </li><li> Nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39; del software, aprire il metodo da eseguire. NOTA: Il metodo run è iniziata in una serie di pagine che comprende il controllo delle variabili del metodo, impostazione raccoglitore di frazioni e che definiscono il nome del file risultato e posizione di memorizzazione. </li><li> Fare clic su Start per avviare la corsa. La corsa può essere monitorata nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39;. </li><li> Al completamento della corsa di purificazione, controlla il cromatogramma risultante nel modulo &#39;Evaluation&#39; nel software di sistema. </li><li> Unire tutte le frazioni contenenti proteine ​​in un tubo, lo scambio buffer separato e concentrarsi in PBS utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo con 30 kDa peso molecolare tagliare. Eseguire le fasi di centrifugazione secondo il fornitore diistruzioni. </li><li> Misurare la concentrazione di anticorpi con test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Se un&#39;altra corsa di purificazione deve essere eseguito, il primo il tubo della pompa di campionamento a tampone di legame e ripetere i passaggi 4,9-4,14. </li><li> Al completamento di piste di depurazione, immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura e lavare il sistema e la colonna interpretato nel passaggio 3. </li><li> Immergere A, B e tubo della pompa campione in etanolo e ripetere la procedura di lavaggio 20% per la memorizzazione del sistema e colonna. </li><li> Scollegare la colonna dalla presa a valle e sostituire colonna tappo, quindi scollegare colonna in ingresso e sostituire tappo, ricollegare tubo al sistema. Conservare la colonna a 4 ° C. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dettagli Questo protocollo transfezione, espressione stabile e la purificazione di un anticorpo terapeutico in cellule HEK-293. espressione stabile di geni anticorpali è il primo passo nel generare una linea cellulare anticorpo-producendo per lo sviluppo e la fabbricazione di un anticorpo terapeutico. Mentre ovariche di criceto cinese (CHO) cellule rimangono la piattaforma espressione di scelta per le proteine ​​terapeutiche, la linea di cellule HEK-293 sta guadagnando importanza con la consapevolezza che le protei...

Il successo di anticorpi terapeutici continua a guidare notevoli investimenti nello sviluppo di anticorpi come un&#39;onda di terapie di nuova generazione ha inizio. Il mercato degli anticorpi dovrebbe essere rimodellato da frammenti di anticorpi 1, anticorpo-farmaco coniugati 2, anticorpi bispecifici 3 e anticorpi ingegnerizzati con proprietà favorevoli 4. Un&#39;altra classe guadagnando interesse farmaceutico sono biosimilari. Gli anticorpi biosimilari sono &#39;molto simile&#39; replicare i prodotti di un anticorpo terapeutico che ha già ricevuto l&#39;approvazione normativa. Un biosimilare proposto deve essere comparabile con l&#39;anticorpo creatore rispetto alla sua struttura, la funzione, la tossicità animale, la sicurezza e l&#39;efficacia clinica, la farmacocinetica umani (PK), farmacodinamica (PD) e l&#39;immunogenicità 5, 6. L&#39;approvazione RAtes di anticorpi biosimilari sono stati lenti a causa dei rigidi vincoli sulla qualità finale del prodotto. I processi di produzione esatte, come linee cellulari e condizioni di coltura specifici attraverso le fasi di lavorazione finali possono rimanere proprietaria. Inoltre, la produzione di anticorpi comporta intrinsecamente una certa variabilità che può aggiungere alla sfida di produrre un prodotto altamente simile. Una caratterizzazione fisico-chimiche e biofisica completa e il confronto è abbastanza difficile, ma una serie di studi che dimostrano le caratteristiche di anticorpi biosimilari stanno emergendo nella letteratura 7, 8, 9. Generazione di un anticorpo terapeutico inizia con la trasfezione di cellule ospiti di mammifero con un vettore che trasporta i geni per il rispettivo anticorpo. disegno vettoriale, condizioni della linea e di coltura cellulare sono considerazioni chiave per la creazione di exsistema di pressione. Le sequenze di DNA di anticorpi possono essere di provenienza da Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o pubblicazioni di ricerca, tra cui brevetti. Ad esempio, la sequenza di trastuzumab è disponibile attraverso Drug Bank (DB ID: DB00072). La sequenza aminoacidica delle regioni variabili può subire Gene design e di ottimizzazione per la sintesi nella specie ospite desiderati. E &#39;importante per un anticorpo biosimilare che nessuna modifica è finalizzata sequenza amminoacidica. Una volta sintetizzato, geni anticorpali possono essere subclonate nel caso vettore di scelta. anticorpi IgG umane sono costituite da due catene pesanti identiche e due catene leggere identici. Espressione strettamente regolata entrambe le catene è essenziale per la produzione ottimale di proteine IgG eterologa in cellule di mammifero 10. Intra nonché legami disolfuro inter-catena deve essere formato e una serie di modificazioni post-traduzionali devono essere introdotti durante biosintesi delle proteine. Un certo numero di vettori sono disponibili che sono stati progettati specificamente per esprimere geni anticorpali (fare riferimento alla tabella dei materiali). Questi vettori specifici anticorpi di solito esprimono le regioni costanti per catene sia pesanti e leggere in modo che solo le regioni variabili di ogni catena richiedono clonazione. Trasfezione delle cellule con due costrutti indipendenti (co-trasfezione) è l&#39;approccio più comune per la distribuzione di geni pesanti e leggeri a catena-codifica. Cioè, ogni gene è azionato da un proprio promotore e trascritto come catene anticorpali separati prima di essere assemblato nel reticolo endoplasmatico. D&#39;altra parte, vettori multi-cistronic hanno elementi interni voce sito ribosoma (IRES) incorporate che consentono l&#39;espressione di geni multipli come un singolo mRNA trascritto con traduzione consentita dalle regioni interne del mRNA 11. In questo esempio, i geni pesanti e leggere catena codificanti sono accoppiati in un arrangement per ottenere co-espressione di entrambe le catene di anticorpi 10, 12. Mentre le cellule trasfettate producono proteine ​​sufficiente per eseguire un numero limitato di esperimenti, linee cellulari stabilmente transfettate che sono sottoposti a selezione per l&#39;integrazione del genoma possono fornire rese più elevate. Importi proteico superiore consentono sviluppo di saggi relativi alla caratterizzazione in vitro e possono fornire un&#39;indicazione della qualità anticorpi in considerazione per applicazioni a valle come linea cellulare clonale e selezione dei candidati piombo. L&#39;obiettivo di questo articolo è descrivere l&#39;espressione stabile e purificazione di un anticorpo terapeutico prodotta in un sistema di espressione di mammifero. Infatti, questo metodo può essere applicato per l&#39;espressione di un anticorpo biosimilare. Il metodo può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale di anticorpi prima di procedere alla critica, seppur ste tempops di identificare un clone auspicabile per ingrandire fabbricazione scala. Inoltre, questo metodo può essere usato per esprimere altre proteine ​​e non solo anticorpi. Il seguente protocollo dettagliato descrive l&#39;espressione di terapeutica trastuzumab anticorpi. Questa consiste nella preparazione del DNA vettoriale seguita da trasfezione stabile in cellule HEK-293 e purificazione di proteine ​​anticorpi con un metodo cromatografico automatizzato.

<table><tbody><tr><td>pFUSE vector series</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td></tr><tr><td>mAbXpress vector series</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>pVITRO1 vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&amp;nbsp; Refer to: Dodev, T. S. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>GS vector series</td><td>Lonza</td><td></td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Multi-cistronic vector series 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&amp;kappa; was a gift from Andrew Beavil.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &amp;micro;g/ml hygromycin.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol, BioXtra, &amp;ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td></tr><tr><td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&amp;nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at -80 &amp;deg;C until use.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Transfection formulated serum-free media</td></tr><tr><td>Hygromycin B Solution</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (casein peptone)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &amp;mu;m filter. Store at 4 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid, monohydrate</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td></tr><tr><td>Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>45-5000</td><td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td></tr><tr><td>Protein A biosensors</td><td>fort&amp;eacute;BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr></tbody></table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Produzione stabile di trastuzumab per trasfettate cellule HEK-293 è stata confermata mediante interferometria bio-layer (BLI), come illustrato nella figura 1. Una curva standard IgG è stato generato misurando il tasso di legame tra un anticorpo standard di IgG e proteina A biosensore (Figura 1A). Il campione supernatante grezzo viene misurata analogamente, quindi la sua concentrazione interpolati dalla curva standard (Figura 1B). La co...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.3K Views.  University of Sydney.  Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità. 

Video: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Ricerca

Medicina

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Protocollo sperimentale per il rilevamento<em&gt; cianobatteri</em&gt; In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Ambiente

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Ricerca sul cancro

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Bioingegneria

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Generazione di anticorpi: produzione di anticorpi monoclonali attraverso l'utilizzo di ibridomi

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia avanzata

Immunologia

Production and Purification of Recombinant Antibodies from Mammalian Cells

Source: Shivange, Gururaj, et al. <a href="https://app.jove.com/v/60727">Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen-Specific Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp.(2020).
The video explains the process of producing antibodies in mammalian host cells, from gene expression to secretion. It involves transcription, translation, signal recognition, correct folding, and eventual release into the extracellular medium via secretory vesicles.

Produzione e purificazione di anticorpi ricombinanti da cellule di mammifero

1. Expression and purification of antibodies

	Maintenance of CHO cells
	
		Grow CHO cells in FreeStyle CHO Media supplemented with commercially available ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Technique to Purify Monoclonal Antibodies Produced by Chinese Hamster Ovary Cells

Source: Velugula-Yellela, S. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58947">Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay for purifying monoclonal antibodies from cell culture fluid harvested from Chinese Hamster Ovarian cells. It employs a porous glass resin with immobilized protein A, which binds to the Fc region of the antibodies in the sample, effectively separating them from contaminants. The use of a low-pH elution buffer weakens the interaction, facilitating the retrieval of purified antibodies.

Una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali prodotti dalle cellule ovariche di criceto cinese

1. Purification of antibody
NOTE: The equilibration buffer for the in-house antibody is 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. The elution buffer used is 0.1 M ...

Antibody Production from a Batch Overgrowth Culture of Transfected Mammalian Cells

Source: Elgundi, Z. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
The video demonstrates a method for producing therapeutic antibodies using stably transfected mammalian cells. Tryptone supplementation stimulates cell division, resulting in overgrowth and supporting a higher antibody yield. The antibody-containing medium is harvested, filtered, and stored for further use.

Produzione di anticorpi da una coltura di crescita eccessiva in batch di cellule di mammifero trasfettate

NOTE: A suitable mammalian expression vector must be used for this protocol. Here, a single construct containing two expression cassettes is used ...

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...