The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

Nota: un adeguato mammiferi vettore di espressione deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui, viene utilizzato un singolo costrutto contenente due cassette di espressione (cioè espressione catena pesante e leggera è guidato dai promotori separate). Trastuzumab catene pesanti e leggere sono stati precedentemente clonati nel vettore. Questo vettore è stato un regalo da Andrew Beavil, ottenuta attraverso un repository plasmide profitto non-per-13. 1. Il recupero e scale-up di vettore DNA NOTA: Vector DNA è stato ricevuto come una cultura pugnalata soft agar in Escherichia coli XL-1 Blue ceppo; vettore trasporta resistenza Hygromycin. <ol><li> Inserire una pugnalata inoculo sterile o ad anello in agar morbido della cultura coltellata poi si depositano su una Luria Bertani (LB) piastra di agar preparata con 75 mg / ml Hygromycin per colonie isolate. Incubare la piastra a 37 ° C per 18-24 ore. </li><li> Inoculare una singola colonia in 5 ml di brodo Terrific (TB) contenente 75 mg / ml Hygromycin. Incubate la cultura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li><li> Utilizzare la cultura durante la notte per preparare uno stock di glicerolo di DNA vettore mescolando delicatamente 800 ml di cultura con 200 ml 80% glicerolo in una provetta Microbank ™ e congelamento a -80 ° C. <ol><li> Aggiungere 100 ml di coltura durante la notte a 100 ml TB contenente 75 ug / ml in un pallone Hygromycin agitatore confuso (cioè 1 / 1.000 diluizione). Incubare la coltura a 37 ° C per 18-24 ore con 225 giri al minuto agitazione. </li></ol></li><li> Dopo cultura durante la notte, estrarre e purificare il DNA in base alle istruzioni del kit di preparazione midi / maxi con la seguente eccezione del fabbricante; durante la fase, eluire o risospendere finale del DNA con acqua (pH 7,0-8,5). </li><li> Controllare la concentrazione e la purezza di DNA da letture di assorbanza a 260 e 280 nm quindi memorizzare DNA a -20 ° C. NOTA: opzionale (altamente consigliato): la sequenza DNA utilizzando primer specifici vettore per confermare l&#39;identità. </li></ol> 2. Trasfezione stabile di cellule HEK-293 <ol><li> Crescere e mantenere HEK-293 cellule (cellule sospensioni) secondo protocolli standard in mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici in beute. Mantenere a 2 x 10 5 cellule / ml e sottocultura ogni quarto giorno. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. NOTA: Le cellule avrebbero dovuto essere in coltura per non meno di 4 giorni e non più di 4 settimane prima della trasfezione. HEK-293 cellule cresciute in monostrati in mezzi di siero contenenti possono anche essere utilizzati per questa procedura. </li><li> Il giorno prima della trasfezione, seme cellule HEK-293 a 3 x 10 5 cellule / ml in pozzetti di una piastra 12 pozzetti in 2 ml di Dulbecco Modified Eagle media (DMEM) supplementato con siero fetale bovino inattivato al calore 10% ( FBS). Il giorno della trasfezione, controllare che le cellule hanno raggiunto 80-90% di confluenza </li><li> Diluire il DNA e polietilenimmina (PEI) separatamente nel supporto di transfezione poi mescolare insieme.<ol><li> Diluire 1,25 mg vettore DNA per bene (15 mg per 12 pozzi) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Diluire 2,5 ml di 1 mg / ml soluzione PEI (30 microlitri per 12 pozzi, cioè rapporto 1: 2 del DNA a PEI) in 300 ml mezzi trasfezione. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere DNA diluito al diluito PEI, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min. </li></ol></li><li> Aggiungere 50 ml di DNA / PEI miscela goccia a goccia a ciascun pozzetto della piastra. Oscillare delicatamente la piastra per distribuire la miscela di trasfezione quindi posizionare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. </li><li> Aggiungere 50 ug / ml Hygromycin B per pozzetto e riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 per 10 giorni. NOTA: Giorno 10, le cellule non-trasfettate saranno morte e distaccata dalla superficie della piastra, mentre le cellule stabilmente transfettate saranno vitale e attaccato alla piastra. </li><li> Sostituire i supporti in pozzi con1/4 media liberi-siero volume e 3/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 0,5 ml mezzi privi di siero + 1,5 ml DMEM = 7,5% concentrazione sierica finale) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 1/2 mezzi privi di siero volume e 1/2 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè mezzi privi di siero 1 ml + 1 ml di DMEM = concentrazione sierica finale 5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 3/4 mezzi privi di siero volume e 1/4 del volume DMEM supplementato con 10% FBS (cioè 1,5 ml mezzi privi di siero + 0,5 ml DMEM = concentrazione sierica di finale 2,5%) e incubare per 4 giorni. </li><li> Sostituire il supporto in pozzi con 2 ml di mezzi privi di siero integrato con 0,1% di tensioattivi non ionici (cioè concentrazione sierica di finale 0%) e incubare per 4 giorni. NOTA: Mantenere 50 mg / igromicina B pressione selettiva ml su cellule durante l&#39;adattamento privo di siero. Le cellule adattate ai mezzi privi di siero si staccano dalla superficie dei pozzi e possono raggruppare iSospensione n. Fare riferimento al punto 2.1 per condizioni di coltura con il supplemento aggiuntivo di 50 mg / ml igromicina B. </li><li> Usando una pipetta, delicatamente mescolare le colture in sospensione nelle cellule piastra e piscina da 12 pozzetti in un tubo separato. <ol><li> Utilizzando un emocitometro, enumerare cellule pool e sementi in 30 ml mezzi privo di siero in una beuta a 2 x 10 5 cellule / ml. Cellule di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2 e 120 di rotazione rpm. Subculture ed espandere ogni quarto giorno. </li></ol></li><li> Continuare a espandere dimensioni coltura a densità cellulare richiesto per ottenere 10 fiale a 1 x 10 7 cellule / fiale per la crioconservazione in azoto liquido. Congelare le cellule in mezzi privi di siero contenente il 10% dimetilsolfossido (DMSO). NOTA: condizionata supporti contenenti anticorpi possono essere raccolte ad ogni sottocultura di confermare la produzione di proteine ​​o utilizzati per ottimizzare le condizioni di purificazione. Per raccogliere i media condizionata e mantenere le cellule di sottocultura, centrifugare la coltura a300 xg per 5 minuti poi filtrare-sterilizzare surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron. surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C per 1-2 settimane o -20 ° C per una conservazione a lungo termine. </li></ol> 3. Large Scale produzione di anticorpi da lotto Erbaiuto Cultura NOTA: La produzione di anticorpi può essere seguita su dal punto 2.11 dove le cellule esistenti vengono espanse per la densità cellulare desiderato in base al volume della cultura overgrow batch per essere messa a punto. Altrimenti, le cellule che sono stati scongelati da crioconservazione iniziano in questa fase, una volta espanso ad una densità cellulare appropriata e volume. Vari supplementi di coltura possono essere utilizzate per ottimizzare la produzione di anticorpi; l&#39;uso di triptone per aumentare la resa degli anticorpi è dimostrato in questo protocollo. <ol><li> Cellule Seed a 2 x 10 5 cellule / ml in 100 ml di mezzi senza siero in due beute (per confrontare i rendimenti di anticorpi provenienti da culture non-integrato e nutrienti integrazioni). Culture a 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt; e 120 giri al minuto. </li><li> Dopo 24 ore, aggiungere triptone ad una concentrazione finale di 0,5% alla cultura nutrienti integrato. Pareggiare il volume della cultura non-integrato con mezzi senza siero. </li><li> Dal giorno 8, eseguire la conta delle cellule delle culture quotidiane utilizzando un emocitometro per monitorare la vitalità cellulare. Raccogliere le sovranatanti una volta la vitalità cellulare è inferiore al 80%. <ol><li> Harvest surnatante mediante centrifugazione delle colture a 3.000 xg per 15 min quindi filtrata-sterilizzare il surnatante (contenente anticorpi) attraverso un filtro di 0,22 micron. Conservare il surnatante a 4 ° C (a breve termine) o congelare a -20 ° C (a lungo termine). </li></ol></li></ol> 4. Anticorpo Purificazione per affinità e cromatografia utilizzo di un cromatografia liquida automatica veloce Protein (FPLC) Sistema NOTA: La seguente procedura può essere generalmente applicata a sistemi più automatizzati. La purificazione può essere eseguita a temperatura ambiente oa 4 ° C (se il sistema FPLC è conservato in una camera fredda).Una serie di test di scouting può essere eseguita per individuare le condizioni ottimali di depurazione tra cui matrice colonna appropriata, tampone, tampone di eluizione e pH vincolante per garantire il massimo recupero di anticorpo purificato dai media condizionati (fare riferimento alla sezione Risultati). Le condizioni ottimali dipendono anticorpi o proteine ​​di essere purificati. Purificazioni sono stati eseguiti su un sistema FPLC automatizzato. Purificazioni state eseguite a temperatura ambiente usando una proteina 5 ml Una colonna. <ol><li> Preparare i seguenti tamponi con acqua ultrapura e regolare il pH consigliato poi filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron. <ol><li> Preparare 1 L di tampone fosfato salino (PBS) a pH 7,4 (tampone di legame) mescolando il seguente: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 e 0,001 M KH 2 PO 4. Aggiustare il pH se necessario prima di filtrare il buffer. </li><li> Preparare 500 ml di 0,1 M glicina-HCl pH 2.7 (tampone di eluizione). Regolare il pH prima di filtrare il buffER. </li><li> Preparare 50 ml di 1 M Tris pH (tampone di neutralizzazione) 9.0. </li></ol></li><li> Assicurarsi che tutti i collegamenti di alimentazione e di comunicazione del sistema con il computer sono fatti. I dispositivi devono essere visibili nel modulo &#39;di controllo del sistema&#39; software. Assicurarsi cella UV è impostata a 280 nm di lunghezza d&#39;onda. Opzionale: Calibrare pH-metro se collegato e da utilizzare. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura per lavare il sistema. Spurgare le pompe con una siringa se c&#39;è aria nella tubazione o sospetto di aria nel sistema. Lavare il sistema con acqua mediante operazione manuale tramite il controllore di sistema o tramite un metodo automatizzato. Si osservi che la pressione, conducibilità, tracciamento UV280 e pH rimane costante e che il limite di pressione per la colonna non sia superato secondo le specifiche del produttore. NOTA: Le anomalie possono indicare l&#39;aria o il blocco del sistema che dovrebbe essere affrontato prima di procedere. </li><li> Nel modulo di controllo del sistema, avviare la portata a 1ml / min manualmente tramite pompa A sia carico (bypassando loop del campione) o iniezione (attraverso il campione loop) grado di iniziare a collegare la colonna. tubing sistema Disconnect all&#39;ingresso posizione di colonna e rimuovere il tappo collegato all&#39;ingresso colonna. <ol><li> Permettere all&#39;acqua di fluire dal tubo a gocce sistema superiore della colonna quindi fissare il tubo di sistema alla colonna. Avendo l&#39;ingresso della colonna e raccordo di ingresso traboccante di gocce d&#39;acqua garantisce un collegamento privo di bolle d&#39;aria. </li></ol></li><li> Collegare l&#39;uscita della colonna in uscita a valle e verificare tutti i raccordi siano ben fissati. Con la colonna ora collegata al sistema, non superare i limiti di massima pressione e portata come descritto nelle specifiche di colonna. </li><li> Lavare colonna con 5 volumi di colonna (CV) di acqua. Se necessario, continuare a lavare colonna fino a UV280 tracciato si è stabilizzata. </li><li> Immergere tubi di ingresso di A in Binding Buffer, B in tampone di eluizione e pompa di campionamento in Binding Buffer to riequilibrare il sistema nei buffer corrette. Riempire i tubi di ingresso con il tampone usando PumpWash per il funzionamento manuale. </li><li> Nel modulo del software &#39;Method Editor&#39;, utilizzare il metodo guidata per impostare un metodo di cromatografia di affinità per la colonna che è destinato ad essere utilizzato. NOTA: e sistemi automatizzati di FPLC sono dotati di metodi di pre-riempita con le impostazioni consigliate (cioè della portata e della pressione limite) ed eseguire operazioni in base alla colonna (produttore, matrice e dimensione) selezionati per la purificazione. <ol><li> Utilizzare i seguenti passi di esecuzione per proteina A cromatografia di affinità: <ol><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li><li> campione di carico nella colonna (volume da caricare viene specificato manualmente nel metodo) e raccogliere eluato in un contenitore separato. </li><li> Sistema di lavaggio con 5 CV di tampone Binding raccogli eluato in un contenitore separato. </li><li> colonna eluire con 5 CV isocratic frazionamento con tampone di eluizione e raccogliere campioni anticorpo purificato come frazioni di raccoglitore di frazioni. </li><li> Equilibrare sistema con 5 CV di tampone di legame e raccogliere eluato nel contenitore dei rifiuti. </li></ol></li></ol></li><li> Una volta che il metodo è stato impostato, specificare il volume di mezzi condizionati da applicare alla colonna e salvare il metodo. NOTA: Il volume specificato nel metodo dovrebbe essere 5-10 ml inferiore al volume reale per evitare l&#39;introduzione di aria durante la corsa del campione. Il volume specificato utilizzato in questo protocollo è 90-120 ml. </li><li> Immergere il tubo della pompa campione nel recipiente contenente il supporto condizionata. </li><li> Preparare un contenitore separato per raccogliere eluato campione attraverso il tubo di uscita specificato. NOTA: E &#39;importante raccogliere l&#39;eluato, nel caso si verifichi un errore durante la corsa o la capacità di legame della colonna viene superata richiede l&#39;eluato per essere riapplicata alla colonna o la purificazione repeated. </li><li> Preparare tubi di raccolta nel raccoglitore di frazioni. Aggiungere 100 ml di tampone di neutralizzazione per 1 ml volume della frazione. Il sistema FPLC si eluire automaticamente le frazioni nei tubi di raccolta. </li><li> Nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39; del software, aprire il metodo da eseguire. NOTA: Il metodo run è iniziata in una serie di pagine che comprende il controllo delle variabili del metodo, impostazione raccoglitore di frazioni e che definiscono il nome del file risultato e posizione di memorizzazione. </li><li> Fare clic su Start per avviare la corsa. La corsa può essere monitorata nel modulo &#39;Sistema di Controllo&#39;. </li><li> Al completamento della corsa di purificazione, controlla il cromatogramma risultante nel modulo &#39;Evaluation&#39; nel software di sistema. </li><li> Unire tutte le frazioni contenenti proteine ​​in un tubo, lo scambio buffer separato e concentrarsi in PBS utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo con 30 kDa peso molecolare tagliare. Eseguire le fasi di centrifugazione secondo il fornitore diistruzioni. </li><li> Misurare la concentrazione di anticorpi con test di acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Se un&#39;altra corsa di purificazione deve essere eseguito, il primo il tubo della pompa di campionamento a tampone di legame e ripetere i passaggi 4,9-4,14. </li><li> Al completamento di piste di depurazione, immergere tubi di ingresso di A, B e pompa di campionamento in acqua ultrapura e lavare il sistema e la colonna interpretato nel passaggio 3. </li><li> Immergere A, B e tubo della pompa campione in etanolo e ripetere la procedura di lavaggio 20% per la memorizzazione del sistema e colonna. </li><li> Scollegare la colonna dalla presa a valle e sostituire colonna tappo, quindi scollegare colonna in ingresso e sostituire tappo, ricollegare tubo al sistema. Conservare la colonna a 4 ° C. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Dettagli Questo protocollo transfezione, espressione stabile e la purificazione di un anticorpo terapeutico in cellule HEK-293. espressione stabile di geni anticorpali è il primo passo nel generare una linea cellulare anticorpo-producendo per lo sviluppo e la fabbricazione di un anticorpo terapeutico. Mentre ovariche di criceto cinese (CHO) cellule rimangono la piattaforma espressione di scelta per le proteine ​​terapeutiche, la linea di cellule HEK-293 sta guadagnando importanza con la consapevolezza che le protei...

Il successo di anticorpi terapeutici continua a guidare notevoli investimenti nello sviluppo di anticorpi come un&#39;onda di terapie di nuova generazione ha inizio. Il mercato degli anticorpi dovrebbe essere rimodellato da frammenti di anticorpi 1, anticorpo-farmaco coniugati 2, anticorpi bispecifici 3 e anticorpi ingegnerizzati con proprietà favorevoli 4. Un&#39;altra classe guadagnando interesse farmaceutico sono biosimilari. Gli anticorpi biosimilari sono &#39;molto simile&#39; replicare i prodotti di un anticorpo terapeutico che ha già ricevuto l&#39;approvazione normativa. Un biosimilare proposto deve essere comparabile con l&#39;anticorpo creatore rispetto alla sua struttura, la funzione, la tossicità animale, la sicurezza e l&#39;efficacia clinica, la farmacocinetica umani (PK), farmacodinamica (PD) e l&#39;immunogenicità 5, 6. L&#39;approvazione RAtes di anticorpi biosimilari sono stati lenti a causa dei rigidi vincoli sulla qualità finale del prodotto. I processi di produzione esatte, come linee cellulari e condizioni di coltura specifici attraverso le fasi di lavorazione finali possono rimanere proprietaria. Inoltre, la produzione di anticorpi comporta intrinsecamente una certa variabilità che può aggiungere alla sfida di produrre un prodotto altamente simile. Una caratterizzazione fisico-chimiche e biofisica completa e il confronto è abbastanza difficile, ma una serie di studi che dimostrano le caratteristiche di anticorpi biosimilari stanno emergendo nella letteratura 7, 8, 9. Generazione di un anticorpo terapeutico inizia con la trasfezione di cellule ospiti di mammifero con un vettore che trasporta i geni per il rispettivo anticorpo. disegno vettoriale, condizioni della linea e di coltura cellulare sono considerazioni chiave per la creazione di exsistema di pressione. Le sequenze di DNA di anticorpi possono essere di provenienza da Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o pubblicazioni di ricerca, tra cui brevetti. Ad esempio, la sequenza di trastuzumab è disponibile attraverso Drug Bank (DB ID: DB00072). La sequenza aminoacidica delle regioni variabili può subire Gene design e di ottimizzazione per la sintesi nella specie ospite desiderati. E &#39;importante per un anticorpo biosimilare che nessuna modifica è finalizzata sequenza amminoacidica. Una volta sintetizzato, geni anticorpali possono essere subclonate nel caso vettore di scelta. anticorpi IgG umane sono costituite da due catene pesanti identiche e due catene leggere identici. Espressione strettamente regolata entrambe le catene è essenziale per la produzione ottimale di proteine IgG eterologa in cellule di mammifero 10. Intra nonché legami disolfuro inter-catena deve essere formato e una serie di modificazioni post-traduzionali devono essere introdotti durante biosintesi delle proteine. Un certo numero di vettori sono disponibili che sono stati progettati specificamente per esprimere geni anticorpali (fare riferimento alla tabella dei materiali). Questi vettori specifici anticorpi di solito esprimono le regioni costanti per catene sia pesanti e leggere in modo che solo le regioni variabili di ogni catena richiedono clonazione. Trasfezione delle cellule con due costrutti indipendenti (co-trasfezione) è l&#39;approccio più comune per la distribuzione di geni pesanti e leggeri a catena-codifica. Cioè, ogni gene è azionato da un proprio promotore e trascritto come catene anticorpali separati prima di essere assemblato nel reticolo endoplasmatico. D&#39;altra parte, vettori multi-cistronic hanno elementi interni voce sito ribosoma (IRES) incorporate che consentono l&#39;espressione di geni multipli come un singolo mRNA trascritto con traduzione consentita dalle regioni interne del mRNA 11. In questo esempio, i geni pesanti e leggere catena codificanti sono accoppiati in un arrangement per ottenere co-espressione di entrambe le catene di anticorpi 10, 12. Mentre le cellule trasfettate producono proteine ​​sufficiente per eseguire un numero limitato di esperimenti, linee cellulari stabilmente transfettate che sono sottoposti a selezione per l&#39;integrazione del genoma possono fornire rese più elevate. Importi proteico superiore consentono sviluppo di saggi relativi alla caratterizzazione in vitro e possono fornire un&#39;indicazione della qualità anticorpi in considerazione per applicazioni a valle come linea cellulare clonale e selezione dei candidati piombo. L&#39;obiettivo di questo articolo è descrivere l&#39;espressione stabile e purificazione di un anticorpo terapeutico prodotta in un sistema di espressione di mammifero. Infatti, questo metodo può essere applicato per l&#39;espressione di un anticorpo biosimilare. Il metodo può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale di anticorpi prima di procedere alla critica, seppur ste tempops di identificare un clone auspicabile per ingrandire fabbricazione scala. Inoltre, questo metodo può essere usato per esprimere altre proteine ​​e non solo anticorpi. Il seguente protocollo dettagliato descrive l&#39;espressione di terapeutica trastuzumab anticorpi. Questa consiste nella preparazione del DNA vettoriale seguita da trasfezione stabile in cellule HEK-293 e purificazione di proteine ​​anticorpi con un metodo cromatografico automatizzato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1730">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">pFUSE vector series</td>
			<td style="width:189px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:1003px;">Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAbXpress vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td>
			<td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1 vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&#160; Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GS vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;</td>
			<td>61883</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro Agar</td>
			<td>fas-hg-s</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &#181;g/ml hygromycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro TB</td>
			<td>fas-hg-l</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &#181;g/ml hygromycin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol, BioXtra, &#8805;99%</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>G221020</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293-F Cells</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Kolliphor P188</td>
			<td>K4894</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose&#160;</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&#160;</td>
			<td>23966</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at -80oC until use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiPro SFM</td>
			<td>12309-050</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Transfection formulated serum-free media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B Solution</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>AJA2225</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tryptone (casein peptone)</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td>
			<td>GE17-0403-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AKTApurifier 100</td>
			<td>28406266</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine-HCl</td>
			<td>G2879</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citric Acid, monohydrate</td>
			<td>BIOC2123</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>BIOCB0035</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td>
			<td>BIOSD8146</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td>
			<td>UFC803008/UFC903008</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td>
			<td>23227</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLItz System</td>
			<td>45-5000</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A biosensors</td>
			<td>18-5010</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td>
			<td>786-502</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>AM0486</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>AM0761</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>786-498</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td>
			<td>1610374</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Produzione stabile di trastuzumab per trasfettate cellule HEK-293 è stata confermata mediante interferometria bio-layer (BLI), come illustrato nella figura 1. Una curva standard IgG è stato generato misurando il tasso di legame tra un anticorpo standard di IgG e proteina A biosensore (Figura 1A). Il campione supernatante grezzo viene misurata analogamente, quindi la sua concentrazione interpolati dalla curva standard (Figura 1B). La co...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità.

Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.2K Views.  University of Sydney.  Questo protocollo descrive la produzione di un anticorpo terapeutico in un sistema di espressione di mammifero. I metodi descritti includono la preparazione del DNA vettore, trasfezione stabile e libero adattamento di siero di una linea di cellule embrionali renali 293 umana, messa a punto di culture su larga scala e la purificazione mediante cromatografia di affinità. 

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Ricerca

Biochimica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Un approccio personalizzabile per la produzione e la purificazione esulta dei prodotti naturali Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...