Questo protocollo descrive una procedura di purificazione completa per la proteina legante il calcio umano, S100A12, e in particolare, per i diversi oligomeri indotti dagli ioni per implicazioni di ricerca a valle. Con questa tecnica, siamo in grado di mantenere l'alta resa di proteine molto pure ed endotossine. Il cross-linking chimico e la separazione sulla colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni è un metodo convincente per generare proteine omo-oligomeriche per ulteriori test funzionali.
La nostra tecnica ci consente di aspetti meccanicistici di S100A12 come ligando del recettore del riconoscimento dei modelli e informazioni artistiche per sviluppare idealmente nuovi interventi mirati e migliorare i test diagnostici. Oltre a guardare questo video, consigliamo un'attenta lettura del protocollo, poiché descriviamo una procedura complessa in più step. Per iniziare, tagliare un tubo di dialisi in una lunghezza appropriata, circa 30 centimetri, con spazio aggiuntivo per l'aria.
Immergere la membrana in acqua deionizzata per 15-30 minuti per rimuovere il glicerolo. Per ridurre la viscosità della soluzione proteica cancellata, diluire la soluzione con 25 millilitri di tampone AIEX A.Attaccare la prima chiusura sul tubo. Caricare il campione nella membrana e fissare la seconda chiusura ad almeno un centimetro dall'estremità superiore del tubo.
In una stanza raffreddata a quattro gradi Celsius, posizionare il contenitore con tampone AIEX A su una piastra di agitazione, aggiungere una barra di agitazione e la membrana piena di soluzione proteica. Regolare la velocità per ruotare il campione in modo che non vi siano interferenze con la barra di agitazione rotante. Dializzare per 12-24 ore a quattro gradi Celsius, quindi sostituire il buffer dializzato con tampone libero pre-raffreddato A e continuare per almeno quattro ore aggiuntive.
Trasferire la soluzione proteica dializzata dal tubo in un tubo da 50 millilitri attraverso un'unità filtrante da 0,45 micron. Avviare l'FPLC con manutenzione generale. Collegare i buffer di colonna AIEX A e AIEX B alle valvole tampone e alla resina di scambio ionico contenente colonna alle porte delle colonne dell'FPLC.
Regolare di conseguenza i parametri cromatografici generali. Avviare il programma AIEX nel software FPLC e scegliere il volume di equilibrazione per il buffer A.Successivamente, caricare il campione sulla colonna ed elutare le proteine con un gradiente lineare dallo 0% al 100% di buffer di sale alto. Raccogliere due frazioni di millilitro durante l'eluizione.
Analizzare le frazioni eluizzate dopo aver terminato la corsa. Per questo, caricare 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata al 15%SDS e identificare le frazioni contenenti S100A12. Mettere in comune questi S100A12 contenenti frazioni per la dialisi in salina tamponata da TRIS.
Per continuare la purificazione proteica, dopo la dialisi proteica, aggiungere un cloruro di calcio al campione a una concentrazione finale di 25 millimolare, che faciliterà il legame di S100A12 alla resina nella fase successiva. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro con una dimensione di versamento di 0,45 micron. Equilibrare i buffer HIC e i campioni a quattro gradi Celsius.
Collegare quindi i buffer di colonna HIC A e B e la colonna al sistema e regolare i parametri. Avviare il metodo per equilibrare la colonna con uno o due volumi di colonna di buffer HIC A e caricare il campione e il blocco campione non associato di lavaggio con un segnale UV raggiunge nuovamente il livello di base. Quindi iniziare l'eluizione con un chelatore di calcio contenente EDTA tampone.
Raccogliere due millilitri di frazioni di picco durante l'eluizione. Dopo aver analizzato 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata del 15%SDS, identificare frazioni S100A12 pure. Mettere in comune queste frazioni e dializzare contro HBS.
In primo luogo, caricare 15 millilitri di campione su un'unità filtrante centrifuga da 50 kilodalton. Centrifuga a 3200 volte g a 10 gradi Celsius per circa 10 minuti. Trasferire il flusso filtrato in un recipiente fresco, sul ghiaccio.
Ora, utilizzare un millilitro di HBS per risciacquare la membrana filtrante e per diluire la soluzione concentrata nella punta del filtro. Centrifugare di nuovo per recuperare quanta più proteina possibile nel flusso. Per filtrare la soluzione, ripetere il carico del campione e la centrifugazione tutte le volte che è necessario.
Successivamente, per concentrare l'S100A12 contenente il flusso, caricarlo in un filtro centrifugo a tre kilodalton e centrifugare a 3200 volte g, 10 gradi Celsius per circa 30 minuti. Ora il volume è ridotto a 1/5 fino a 1/10 del volume di carico iniziale. Trasferire la soluzione concentrata in un nuovo tubo.
Ripetere il passaggio di concentrazione tutte le volte che è necessario. Dopo il cross-linking chimico, secondo il manoscritto, eseguire la cromatografia ad esclusione delle dimensioni. Equilibrare la colonna in HBS, caricare il campione e raccogliere frazioni di picco da uno a due millilitri durante la corsa.
Dopo aver analizzato queste frazioni su una pagina SDS dal 4 al 20%, le frazioni di pool con le bande principali del complesso proteico desiderato. Quindi concentrare le soluzioni come fatto in precedenza. Per isolare i monociti dai cappotti buffy umani per centrifugazione gradiente di densità, equilibrare prima la soluzione di separazione a temperatura ambiente.
Trasferire 20 millilitri in tubi di centrifuga da 15 millilitri, due tubi per strato buffy. Diluire il sangue dal mantello di buffy umana con HBSS a un volume totale di 60 millilitri e strato 30 millilitri di questa miscela con attenzione sopra il mezzo di separazione. Centrifuga a 550 volte g per 35 minuti a temperatura ambiente.
Spegnere il freno della centrifuga. Dopo la centrifugazione, le cellule del sangue periferiche mononucleari si trovano direttamente sopra il mezzo di separazione. Con una pipetta, trasferire queste cellule in un tubo di centrifuga fresco da 50 millilitri.
Riempire il tubo con HBSS a 50 millilitri e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di HBSS pipettando. Quindi, riempire il tubo fino a 50 millilitri e centrifugare a 290 volte g per 10 minuti.
Aspira di nuovo il supernatante. Rimospendare le cellule in 50 millilitri di HBSS e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di un millilitro di tampone di separazione, contare le cellule e aggiungere tampone a una concentrazione di cinque volte 10 alle sette cellule per millilitro.
Per l'isolamento dei monociti dalle cellule del sangue periferiche mononucleari, utilizzare un kit di isolamento cellulare negativo magnetico e seguire il protocollo del produttore. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare i monociti e il resuspend in mezzo monocito a una concentrazione di due volte 10 alle sei cellule per millilitro. Per coltura dei monociti, stendere un piatto di coltura cellulare con un film permeabile al gas idrofobico adatto alle celle di sospensione.
Posizionare le piastre sotto la luce UV per circa 30 minuti per la sterilizzazione. Trasferire da 15 a 25 millilitri della sospensione cellulare a queste piastre di coltura e lasciarli riposare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la pre-purificazione sulla colonna AIEX e la successiva HIC dipendente dal calcio, è stata ottenuta una proteina altamente pura.
Come ulteriore controllo, i monociti umani sono stati stimolati con l'LPS e hanno prodotto proteine di tipo selvatico. L'esposizione proteica a diversi ioni si traduce in una disposizione di diversi oligomeri S100A12. L'aumento delle concentrazioni di zinco induce la disposizione di S100A12 in tetrameri ed esameri al momento della separazione sulla pagina SDS macchiata da quattro a 20%Coomassie.
Quando un eccesso di ioni è stato applicato prima del collegamento incrociato, ha indotto uno spostamento pronunciato dell'equilibrio oligomero. S100A12 è stato incrociato in presenza di calcio 25 millimolare o 25 millimolare di calcio e uno zinco millimolare. Dopo il collegamento incrociato nel tampone HBS con cloruro di calcio millimolare e un cloruro di zinco millimolare, esamero e tetramero sono stati separati.
Tetramero e dimero sono stati separati in tampone HBS con cloruro di calcio millimolare da 25 millimolare. Un esempio di oligomeri raggruppati e concentrati dopo la separazione su una pagina SDS sfumato da quattro a 15% mostra dimero, tetramero ed esamero. La stimolazione monocitare con esamerico S100A12 ha provocato un rilascio alfa TNF pronunciato.
Dopo la rimozione dell'endotossina, è importante non reintrodurre la contaminazione nei campioni durante la successiva generazione e purificazione degli oligomeri. L'analisi a valle di qualsiasi processo relativo all'oligomerizzazione S100A12 è concepibile. Allo stesso modo, possono essere analizzati gli amminoacidi e le condizioni ioniche che influenzano il processo di oligomerizzazione stesso.
Attualmente stiamo usando oligomeri S100A12 separati secondo il protocollo descritto per sviluppare ligandi peptidici specifici e anticorpi per bloccare la segnalazione della proteina attraverso TLF4 e per sviluppare e migliorare i test diagnostici.
