Questo metodo consente un modo più efficace per quantificare l'attività della chitinasi nei campioni biologici. L'attività chitinasi ha dimostrato di servire come un buon marcatore per la diagnosi e l'efficacia terapeutica in numerose condizioni e malattie. I metodi precedenti per la misurazione dell'attività chitinasi erano spesso dispendiosi in termini di tempo e difficili da eseguire, entrambi problemi che sono stati risolti dal saggio qui mostrato.
Questa tecnica aiuterà a soddisfare le potenziali chitinasi come marcatore diagnostico e terapeutico rendendo più facile misurare l'attività chitinasi;ad esempio, può essere utilizzata per monitorare il trattamento della malattia di Gaucher perché l'attività chitinasi ha dimostrato di diminuire durante un trattamento efficace. Inizia preparando substrati, standard e soluzioni per il test. Preparare 1 tampone McIlvain secondo le indicazioni del manoscritto e utilizzarlo per diluire i substrati di chitina a 500 micromolari ciascuno.
Sciogliere 4-metillumbelliferone, lo standard, a una concentrazione di 0,1 millimolare in tampone di arresto per creare una soluzione standard di stock di curve. Per ogni 10 campioni, mescolare 2,17 millilitri di tampone McIlvain 1x con 100 microlitri del substrato di chitina per creare una soluzione di lavoro, quindi pipettare 95 microlitri della soluzione di lavoro in ogni pozzo di una piastra da 96. Aggiungere cinque microlitri del campione di prova a ciascun pozzo e mescolarlo nella soluzione di lavoro.
Coprire la piastra e scuoterla per cinque secondi, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la reazione enzimatica. Nel frattempo, diluire la soluzione stock di 4-metillumbelliferone per creare una soluzione standard di lavoro a cinque micromolari e creare una curva standard preparando una serie di diluizioni secondo il manoscritto. Iniziare con la concentrazione di cinque micromolari e mescolare bene ogni diluizione.
Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di tampone di arresto ad ogni pozzo per fermare la reazione. Aggiungere 300 microliter duplicati di ogni standard alla stessa piastra, quindi leggere la piastra ad un'eccitazione di 360 nanometri e un'emissione di 455 nanometri. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per misurare l'attività della chitinasi nella lavanda broncoalveolare e nel liquido siero di tipo selvatico e nella chitotriosidasi che esprime esente da topi transgenici.
Il saggio conferma che l'iperespressione del gene CHIT-1 nei topi si traduce in un aumento dell'attività chitinasi. Una curva standard è stata utilizzata per determinare la chitinasi in base alla fluorescenza dei campioni. La cosa più importante da ricordare quando si tenta per la prima volta il protocollo è aggiungere i campioni nel modo più rapido ed efficiente possibile pur mescolando accuratamente.
Quando inizi per la prima volta, potrebbe essere utile fare meno campioni per corsa per garantire l'accuratezza nelle misurazioni, a causa di un periodo di incubazione più breve.
