Name: flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood at JoVE.com

This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Raccolta Sangue intero <ol><li> Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità. </li><li> Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta del sangue contenente acido Di-Potassio etilendiamminotetraacetico (K 2 EDTA). Capovolgere tubo di raccolta sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta di sangue a temperatura ambiente su un agitatore meccanico banco fino separazione. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule bersaglio Dio-etichettati <ol><li> Crescere K562 cellule in completa di Iscove Modified Dulbecco media (IMDM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina streptomicina per diverse settimane prima del test per garantire la salute delle cellule. Regolare il concentratione delle cellule per 3 x 10 5 cellule / ml al giorno attraverso il completamento di una cella di conteggio e successivo passaggio delle cellule. Eseguire un completo cambiamento dei media ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Il giorno del test, eseguire una conta cellulare utilizzando un 1: 1 emocitometro. <ol><li> Rimuovere 10 microlitri dal pallone K562 e posto in 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml di colorante blu trypan nella stessa provetta da 1,5 ml per un fattore di diluizione di 1: 1. </li><li> Delicatamente a scatti la provetta per mescolare K562 cellule e trypan colorante blu. </li><li> Lasciare K562 colorante blu cellula-trypan per incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere 15 ml di cellule K562 macchiati dal tubo. </li><li> Pipetta su emocitometro per la conta delle cellule. </li><li> Contare le celle nelle quattro piazze d&#39;angolo così come la piazza centrale per un totale di cinque piazze. </li><li> Calcolare conta cellulare utilizzando l&#39;equazione: Totale cellule / ml = cellule totali contate X (fattore di diluizione / numero di caselle) X 10.000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Risospendere le cellule bersaglio K562 con una densità finale di 1 x 10 6 cellule / ml in terreno di coltura libera IMDM siero. </li><li> Per le cellule bersaglio K562 senza macchia, aggiungere 10 ml di cellule bersaglio K562 a uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562. Mettere in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Per le cellule bersaglio DiO macchiato K562, aggiungere 10 ml di K562 obiettivi cellule ad uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562. <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione DiO cella-etichettatura per ml di sospensione cellulare in 15 ml di tubo designato per DiO colorazione e delicatamente vortice. Ad esempio, aggiungere 10 ml di soluzione di cellule-etichettatura DiO a 10 x 10 6 cellule / ml K562 ad un volume di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Incubare soluzione K562-DiO per 20 min a 37 ° C con 5% di CO 2 in una provetta da 15 ml. </li></ol></li><li> Seguiincubazione ing, aggiungere 3 ml di soluzione fisiologica a temperatura ambiente tampone fosfato (PBS) per soluzione K562-dio contenente 15 ml di tubo. </li><li> Centrifugare per 10 min a 135 xg a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet cellulare con 1.000 ml di volume regolabile pipetta. </li><li> Aggiungere 10 ml di IMDM fresco alla cella pellet contenente 15 ml di tubo. </li><li> Delicatamente tubo vortex per risospendere le cellule. </li><li> Ripetere i punti 2.7 a 2.10 altre due volte. </li><li> Cellule Conservare in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Le celle possono essere memorizzati in incubatrice fino a 24 h, ma è preferibile usarli lo stesso giorno. </li></ol> 3. Preparazione di controlli <ol><li> Trasferire il seguente in separati e opportunamente etichettati tubi da 1,5 ml: <ol><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso DIO-etichettato K562 cellule nel &quot;Double Positive&quot; etichettato 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso cellule K562 DIO-etichettati in &quot;Dio solo&quot; etichettato 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente cellule K562 senza etichetta risospese nella &quot;ioduro di propidio (PI) solo&quot; etichettati 1,5 ml di tubo. </li></ol></li><li> Posizionare il doppio positivo e PI solo tubi in un bagno d&#39;acqua C 55 ° per 5 min. </li><li> Dopo la 5 minuti è trascorso, rimuovere i tubi e pulire con il 70% di etanolo. </li><li> Aggiungere 10 L di PI al doppio positivo e PI solo 1,5 mL. </li><li> Mettere tutti i tre controlli K562 cellule bersaglio in incubatore a 37 ° C per 30 min. </li><li> Dopo 30 min di incubazione è trascorso, centrifugare tutti i tre controlli di cellule bersaglio K562 per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere ogni controllo con 20 ml di mezzi di coltura cellulare IMDM fresco, e lasciare nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per almeno30 min per il segnale DiO ottimale. NOTA: I controlli sono ora pronti per essere eseguito attraverso il flusso di imaging citometro. </li></ol> 4. NK cellulare automatizzata Separazione <ol><li> Accendere separatore cellulare e consentire il ciclo di start-up alla fine. </li><li> Assicurarsi che tutte le bottiglie di illuminazioni fluidi sono verdi e che la bottiglia è vuota rifiuti. </li><li> Ottenere un ambiente a temperatura 15 ml portaprovette. NOTA: La selezione è basata su volumi di campione. Ad esempio, per un volume inferiore a 3 ml utilizzano un portaprovette 15 ml e per un volume superiore a 3 mL utilizzano una mL cremagliera 50 del tubo. </li><li> tubi campione Etichetta di conseguenza (Ripeti per campione / partecipante): Partecipante 1 campione di sangue intero; Partecipante 1 frazione negativa; Partecipante 1 frazione positiva. </li><li> pipettare delicatamente 1,5 ml di sangue intero dal punto 1.2 in 15 tubo &quot;intero campione di sangue&quot; mL. </li><li> Posizionare il tubo adeguatamente etichettati 15 mL &quot;intero campione di sangue&quot; dal punto 4.5 ed etichettati 15 mL &quot;frazione negativa&quot; etubi &quot;frazione positiva&quot; dal passo 4.4 nel rack tubo. Utilizzare thefollowing cremagliera campione di set-up: Riga (R1) A: Campione di sangue intero, Fila (R2) B: Negativo, frazione senza etichetta, Fila (R4) C: Positivo, frazione magneticamente etichettati. </li><li> Inserire il rack di separazione sul MiniSampler per autolabeling. </li><li> Selezionare &quot;reagente&quot; sul menu ed evidenziare la posizione in cui il flaconcino verrà inserito nel rack separatore. </li><li> Selezionare &quot;Leggi reagente&quot; per attivare il lettore di codici 2D. </li><li> Posizionare la fiala reattivo appropriato davanti al lettore di codici 2D tra 0,5-2,5 cm dal coperchio del lettore di codice. NOTA: per esempio, il reagente necessario per la separazione delle cellule NK è CD56. </li><li> Tenere reagente flacone con un angolo di fronte lettore di codici 2D per una lettura ottimale. </li><li> Posizionare il flacone di reagente in posizione corretta cremagliera separatore. </li><li> Evidenziare le posizioni desiderate nella scheda di separazione sullo schermo. </li><li> Dal sottomenu Etichettatura, assegnare un auprogramma di tolabeling. </li><li> Assegnare le cellule di separazione reagente CD56 microsfere di accumulare posizioni 1, 2, 3, e 4. </li><li> Selezionare il programma di separazione &quot;posselwb&quot;. </li><li> Selezionare il programma di lavaggio &quot;risciacquo&quot;. </li><li> Inserire un volume di campione di 1.500 ml nel sottomenu &quot;Volume&quot; utilizzando il tastierino numerico. </li><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;Invio&quot; sulla tastiera. </li><li> Selezionare &quot;Run&quot; per avviare la separazione delle cellule. </li><li> Selezionare &quot;OK&quot; per confermare tale buffer sufficiente è disponibile per l&#39;elaborazione di tutti i campioni. </li></ol> 5. NK cellulare Conte seguito cellulare Separazione <ol><li> Immediatamente dopo separazione cellulare con il separatore cellulare, recuperare la frazione positiva. Lasciare a temperatura ambiente. Questa frazione contiene la popolazione di cellule NK puro desiderato. </li><li> Per ogni singolo campione, eseguire una conta delle cellule utilizzando un emocitometro come da Fase 2.2. <ol><li> Dopo i calcoli, registrare la conta delle cellule. </li&gt; </ol></li></ol> 6. citotossicità Assay Preparazione del campione <ol><li> Preparare ed etichettare provette da 1,5 ml per ogni campione / partecipante di conseguenza. </li><li> Pipetta rapporto tra cellule NK e K562 DIO-etichettati desiderato in ogni provetta. NOTA: per esempio, il rapporto desiderato di cellule bersaglio K562 e cellule effettrici NK è 1: 5. </li><li> Centrifugare per 5 min a 135 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere NK-dio etichettato miscela di cellule K562 in 500 ml di mezzi delle cellule NK, senza l&#39;interleuchina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanolo (2-ME) (incompleta NK coltura cellulare media). NOTA: I terreni di coltura delle cellule NK incompleta è Minimum Essential medio di Eagle con bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, ribonucleosides e deoxyribonucleosides. </li><li> Aggiungere 5 ml di PI ad ogni provetta. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 163 x g. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo 2 ore di incubazione, centrifuge per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 25 microlitri incompleta terreni di coltura delle cellule NK. </li></ol> 7. Preparazione di spontanea ( &quot;S&quot;) Esempio <ol><li> Pipettare 500 ml di cellule K562 DIO-etichettati (concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml) in 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml di PI ad ogni provetta. </li><li> provetta per centrifuga per 2 min a 163 x g. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo 2 h di incubazione, centrifugare per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 25 ml incompleta Essential Medium (α-MEM) terreni di coltura delle cellule alfa-minimo. </li></ol> 8. Acquisizione dati con Imaging citofluorimetro <ol><li> Premere il tasto verde all&#39;interno dello sportello anteriore della dell&#39;imaging citofluorimetro per accendere lo strumento. </li><li> Attivare all computer associati imaging citofluorimetro. </li><li> Avviare il flusso di imaging citometro software. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avvio&quot; per lavare il sistema e preparare la linea del campione. </li><li> Una volta che il &quot;Avvio&quot; è completa, chiudere la finestra &quot;Calibrations&quot;. </li><li> Assegnare i canali: sul lato superiore sinistro, cliccare su ogni canale, al fine di assegnare loro. </li><li> Sul lato destro, fare clic sul pulsante grafico a dispersione per creare 4 a dispersione: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Crudo Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Crudo Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Iniziare l&#39;analisi di campioni in primo luogo usando il comando &quot;Doppio positivo&quot;. <ol><li> Clicca su &quot;Carica&quot;. </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml con il campione &quot;Double Positive&quot; da Piazza di 3,4 a 3,9 nel caricatore del campione. </li><li> Selezionare l&#39;obiettivo 40X nella scheda &quot;ingrandimento&quot;. </li><li> Accendere il 405 mW e642 laser MW. </li><li> Accendere il canale &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Seleziona intensità.&quot; </li><li> Sulla base del campione di controllo &quot;Double positivo&quot;, determinare l&#39;intensità desiderata per il laser 405 mW quindi il rivelatore non è sovraccarico. Nota: Ad esempio, l&#39;intensità ottimale per questo esperimento è stato fissato a 11 mW. </li></ol></li><li> Dopo il set-up desiderato si ottiene, acquisire i dati. <ol><li> Nella scheda &quot;File di acquisizione&quot;, inserire il nome del file in un testo personalizzato. Selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). </li><li> Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a &quot;raccogliere&quot;. In genere questo numero varia tra 1.000 a 10.000. </li><li> Clicca su &quot;Acquisisci&quot;. NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;acquisizione termina, caricare il campione di controllo successivo - Dio solo il controllo. </strong&gt; <ol><li> Clicca su &quot;Carica&quot;. </li><li> Posizionare il tubo 1,5 ml con l &#39; &quot;unico Dio&quot; campione nel caricatore di campione. </li><li> Lasciare l&#39;obiettivo 40X nella scheda &quot;ingrandimento&quot; selezionato. </li><li> Lasciare il laser 405 mW acceso. </li><li> Spegnere il laser 642 mW e il canale &quot;Brightfield&quot;. NOTA: Ora che la desiderata set-up è stato raggiunto, i dati possono essere acquisiti. </li><li> Nella scheda &quot;File di acquisizione&quot;, inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a &quot;raccogliere&quot;.. In genere questo numero è 1.000. </li><li> Clicca su &quot;Acquisisci&quot;. NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol></li><li> Ripetere il passaggio 8.10 per il &quot;solo PI&quot; campione di controllo. I campioni sperimentali sono ora pronti per essere raccolti. </li><li> Gestire le remaining campioni sperimentali, tra cui i &quot;Campioni spontanee&quot; S &quot;&quot; come segue: <ol><li> Lasciare l&#39;obiettivo 40X nella scheda &quot;ingrandimento&quot; selezionato. </li><li> Accendere il 405 mW e 642 mW laser. </li><li> Attivare il canale &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Clicca su &quot;Imposta intensità.&quot; </li><li> Nella scheda &quot;File di acquisizione&quot;, inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire in un testo il nome del file personalizzato. </li><li> Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a &quot;raccogliere&quot;. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Acquisisci&quot;. NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol></li><li> Ripetere il passaggio 8.12 per tutti i campioni sperimentali. </li><li> Dopo che tutti i dati sperimentali e file sono stati raccolti, fare clic sul pulsante &quot;Shutdown&quot; per sterilizzare il sistema. </li></ol> 9. ImaginAnalisi dei campioni g citofluorimetro <ol><li> Aprire il flusso di imaging citometro applicazione software di analisi. </li><li> Sotto &quot;File&quot;, aprire un file .RIF sperimentale. </li><li> Costruire una nuova matrice utilizzando i file .RIF singolo colore (Dio-solo il controllo e il controllo PI-only, creato durante fasi 8.10 e 8.11) selezionando &quot;Crea un nuovo Matrix&quot; nella scheda di compensazione nel flusso di immagini citometro software. NOTA: Il software chiederà per la selezione dei file a colori singoli e unirli per creare un file di matrice (estensione del file .ctm), che deve essere selezionato per applicare la compensazione del canale. </li><li> Creare diagrammi di punti utilizzando la funzione di &quot;mattoni&quot; del software. <ol><li> Creare un dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequency) per porta le cellule mirate. Chiama il cancello &quot;Focus&quot; (Figura 1A). </li><li> Utilizzando la porta &quot;Focus&quot;, creare un diagramma a punti di Bright Campo Area vs campo luminoso Proporzioni di g<html> mangiato le cellule di singoletto. Chiama il cancello &quot;Single&quot; (Figura 1B). </li><li> Utilizzando la porta &quot;Single&quot;, creare un diagramma a punti di Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilizzare questa trama per identificare e porta Dio-positivo solo le cellule (obiettivi, vivo) e PI-dio cellule doppio positive (obiettivi, morte) (Figura 1C). NOTA: Tutte le trame descritto nei punti 9.4.1, 9.4.2, 9.4.3 e possono essere creati utilizzando la funzione &quot;mattoni&quot; del software. </li></ol></li><li> Fare clic sulla funzione statistica della trama punto per accedere ai numeri cellulari di ogni porta. </li><li> Calcolare la percentuale di bersagli morti nel campione spontanea e campioni sperimentali utilizzando la seguente formula: % bersagli morti in campione = (target #dead x 100) / (# vivono obiettivi + #dead obiettivi) </li><li> Calcolare citotossicità utilizzando la seguente formula: % Citotossicità = [(Experimental dead-spontaneo morto) / (morto 100-spontaneo)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Figura 1: istogrammi rappresentativi, grafici a dispersione e le immagini per l&#39;analisi attività citotossica. Analisi (A) cella di messa a fuoco. (B) analisi singola cella. Analisi (C) bersaglio colorazione delle cellule. Tutte le determinazioni sono realizzati con l&#39;immagine allegata ad ogni evento. Questo può essere letta in software di analisi, semplicemente cliccando sulla manifestazione sui grafici. (D) immagine rappresentativa di un evento doppietto, che mostra un cellulare per apoptosi NK e un obiettivo K562 dal vivo. CH01, Brightfield. Ch02, DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The authors have nothing to disclose.

Il metodo descritto in questo studio misura direttamente l&#39;attività specifica di cellule NK di un individuo in risposta a stimoli (in questo caso particolare, esercizio prolungato). Tipicamente, le cellule NK sono isolati dal proprio sangue utilizzando gradienti di densità o di separazione delle cellule utilizzando una combinazione di marcatori. Mentre questi metodi sono ampiamente utilizzati, hanno molti svantaggi: sono in termini di tempo, coinvolgono più manipolazioni, e sono fortemente dipendenti dell&#39;ute...

cellule killer naturali sono un elemento essenziale del sistema immunitario innato. Mentre sono molto disciplinati, hanno la capacità di riconoscere ed eliminare le cellule anomale attraverso il contatto cellula-cellula e senza attivazione preventiva 1. Come tali, essi formano una linea veloce di difesa contro le infezioni. Esercizio, particolarmente intenso, ha dimostrato di deprimere transitoriamente il sistema immunitario 2, 3, 4, 5. Cellule NK sono particolarmente soggetti a questo effetto 4, 6, 7, creando una finestra di una maggiore sensibilità alla malattia. Pertanto, lo studio di interventi prima, durante o dopo un intenso esercizio con l&#39;obiettivo di ridurre l&#39;impatto sulla funzione delle cellule NK è di particolare interesse per il benessere degli atleti post-concorsi. 8, a circa l&#39;1% del vano globuli bianchi; 2) le cellule NK sono molto sensibili allo stress e si basano su costante esposizione a condizioni fisiologiche di rimanere vitali e stabile durante la sperimentazione; e 3) test standard per determinare la citotossicità delle cellule NK, come Ficoll gradienti 9 e rilasciare dosaggi 10, sono inaffidabili e inconsistenti. La variabilità intrinseca dei campioni umani composti soltanto questi problemi. campioni umani freschi raccolti durante interventi sono abbastanza regolamentato e difficili da procurare, almeno rispetto ai campioni animali o linee cellulari immortalizzate. Questo riduce la possibilità di ripetere gli esperimenti o aggiungere partecipanti allo studio di coorte per raggiungere significativi soglie statistiche. Collettivamente, questi problemi sostengono la necessità di un protocollo semplificato che permette FOR sia high-throughput e l&#39;analisi ad alta affidabilità di NK attività litica delle cellule in campioni umani. Abbiamo stabilito un flusso di lavoro che riduce il tempo necessario per identificare, isolare e le cellule NK di prova da sangue intero umano, riducendo al minimo l&#39;esposizione a fattori estranei. Il metodo ottimizza l&#39;uso di due strumenti, un sorter magnetico a base cellulare e un flusso di imaging citometro, ed una, T ottimizzata specifico per il dosaggio: rapporto E per consentire il rilevamento di diminuzioni o incrementi di citotossicità delle cellule NK.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymphoblasts</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Tissue culture grade</td></tr><tr><td>Propridium Iodide Staining Solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cell-labeling solution</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>No calcium or magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, September 2013</td></tr><tr><td>Ideas Application Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version 6.1, July 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometric analysis of natural killer cell lytic activity in human whole blood

citotossicità delle cellule NK è una misura ampiamente utilizzato per determinare l&#39;effetto di un intervento esterno sulla funzione delle cellule NK. Tuttavia, la precisione e la riproducibilità di questo test possono essere considerati instabili, sia a causa di errori dell&#39;utente oa causa della sensibilità delle cellule NK di manipolazione sperimentale. Per eliminare questi problemi, un flusso di lavoro che li riduce al minimo è stato stabilito ed è presentato qui. Per illustrare, abbiamo ottenuto campioni di sangue, in vari momenti, da corridori (n = 4), che sono stati sottoposti ad un intenso periodo di esercizio. In primo luogo, le cellule NK sono contemporaneamente identificati e isolati attraverso CD56 tagging e smistamento magnetico-based, direttamente dal sangue intero e da un minimo di un millilitro. Le cellule NK ordinati vengono rimossi di eventuali anticorpi reagenti o tappatura. Essi possono essere contati per stabilire un accurato conteggio delle cellule NK per millilitro di sangue. In secondo luogo, le cellule NK ordinati (effettori cellule o E) possono essere miscelati con 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etichettato cellule K562 (cellule bersaglio o T) in un saggio-ottimale 1: 5 T: rapporto E e analizzato utilizzando un flusso-citometria di imaging che permette la visualizzazione di ogni evento e l&#39;eliminazione di falsi positivi o falsi negativi (come doppiette o cellule effettrici). Questo flusso di lavoro può essere completato in circa 4 ore, e consente di ottenere risultati molto stabili anche quando si lavora con campioni umani. Quando disponibile, gruppi di ricerca possono testare diversi interventi sperimentali in soggetti umani, e confrontare le misurazioni attraverso diversi punti di tempo senza compromettere l&#39;integrità dei dati.

Determinazione del numero di cellule NK L&#39;effetto della corsa pesante sul conteggio delle cellule NK nel sangue intero è stato misurato, utilizzando il protocollo di esercizio descritto nella Figura 2. I campioni di sangue sono stati elaborati prima dell&#39;esercizio, immediatamente dopo l&#39;esercizio, 1,5 ore dopo l&#39;esercizio, e, infine, 24 e 48 ore dopo il prelievo di sangue iniziale. La concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è...

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Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Views.  North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus. This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Video: Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

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Immunologia e infezioni

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Valutazione degli eventi delle cellule natural killer umane guidati dall'impegno di FcγRIIIa nella presenza di anticorpi terapeutici

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by clearing pathogen-infected, malignant, and stressed cells. The ability of NK cells to eradicate cancer cells makes them an important tool in the fight against cancer. Several new immune-based therapies are under investigation for cancer treatment which rely either on enhancing NK cell activity or increasing the sensitivity of cancer cells to NK cell-mediated eradication. However, to effectively develop these therapeutic approaches, cost-effective in vitro assays to monitor NK cell-mediated cytotoxicity and migration are also needed. Here, we present two in vitro protocols that can reliably and reproducibly monitor the effect of NK-cell cytotoxicity on cancer cells (or other target cells). These protocols are non-radioactivity-based, simple to set up, and can be scaled up for high-throughput screening. We also present a flow cytometry-based protocol to quantitatively monitor NK cell migration, which can also be scaled up for high-throughput screening. Collectively, these three protocols can be used to monitor key aspects of NK cell activity that are necessary for the cells&#39; ability to eradicate dysfunctional target cells.

Evasion of natural killer (NK) cell-mediated eradication by cancer cells is important for cancer initiation and progression. Here, we present two non-radioactivity-based protocols to evaluate NK cell-mediated cytotoxicity toward hepatic tumor cells. Additionally, a third protocol is presented to analyze NK cell migration.

Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule Killer naturali nel contesto delle cellule tumorali epatiche

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Medicina

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Preparazione del campione per il saggio di citotossicità cellulo-mediata Natural Killer per l'analisi citofluorimetrica

1.&#160;Preparation of Controls

	Transfer the following into separate and appropriately labeled 1.5 ml tubes:
	
		Add 500 &#181;L of fresh IMDM ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Source: Baik, C. H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58961">A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

Un test in vitro per la valutazione della citotossicità delle cellule natural killer contro le cellule tumorali

1. Cytotoxicity Assay: Assay Protocol

	Use a round bottom, culture treated 96-well plate to set up the plate as suggested in Table 1. This table shows ...