Il vantaggio principale del nostro protocollo di genotipizzazione è che riduce al minimo la contaminazione con il DNA materno, che è la sfida principale quando si genotipizzano tessuti molari fissi alla formalina e incorporati nella paraffina. La citometria a flusso è un metodo veloce ed economico che facilita notevolmente la diagnosi di talpe idatidiformi. Per ogni sezione di paraffina fissa formalina, o FFPE, prodotto di concepimento, preparare una sezione di macchie di ematossilina ed eosina spessa quattro micron come descritto in questo video per la valutazione morfologica mediante microscopia.
Posizionare i blocchi FFPE sul ghiaccio per 15 minuti per facilitare il sessatura. Regolare il microtomo per tagliare sezioni spesse quattro micron per una valutazione morfologica microscopica. Posizionare il blocco freddo nel microtomo e tagliare una sezione da ogni blocco per la colorazione H&E.
Utilizzando le forcep, trasferire ogni sezione in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius. Raccogliere la sezione dal bagno d'acqua con una diapositiva caricata positivamente precedentemente etichettata con il numero di identificazione del campione utilizzando una matita. Posizionare le diapositive contenenti le sezioni in un forno a 65 gradi Celsius per consentire alle sezioni di aderire alle diapositive.
Tenere gli scivoli nel forno per 25 minuti. Eseguire la colorazione H&E immergendo le diapositive nei barattoli di colorazione appropriati per il periodo di tempo corretto come tabulato nel protocollo di testo. Montare le sezioni di quattro micron per l'analisi morfologica con mezzo di montaggio.
E coprire con slip di copertura in vetro. Utilizzando le diapositive H&E e un microscopio a luce, selezionare il blocco FFPE che ha la maggiore quantità di villi corionici. E se possibile, il blocco che ha villi corionici si separa e non si mescola con i tessuti materni.
Regolare il microtomo per tagliare sezioni spesse 10 micron per l'estrazione del DNA. Tagliare da 10 a 30 sezioni, a seconda della quantità di villi corionici nel blocco. Dopo aver raccolto le sezioni con diapositive come prima, posizionare le diapositive contenenti le sezioni in un forno a 65 gradi Celsius per consentire alle sezioni di aderire alle diapositive.
Tenere gli scivoli nel forno per 20 minuti. Eseguire la colorazione H&E immergendo le diapositive nei barattoli di colorazione appropriati per il periodo di tempo corretto come tabulato nel protocollo di testo. Lasciare gli scivoli sotto la cappa dei fumi per un minimo di tre ore affinché gli odori tossici di xilene si dissipano.
Usando le forcep, strappare un piccolo pezzo di carta da una salvietta di carta inumidita. Sotto un microscopio stereo leggero, utilizzare le forcep e piccoli pezzi di salviette di carta inumidite ad acqua per raschiare tutti i tessuti materni indesiderati dalle macchie di H&E sezioni spesse 10 micron. La chiave per questo passaggio è la pazienza, soprattutto per i blocchi impegnativi.
È anche importante che qualcun altro dia un'occhiata per garantire che non manchino tessuti materni. Ora, strappare un nuovo pezzo di carta dalle salviette di carta inumidite e usarlo per raccogliere i villi corionici. Mettere i pezzi di salviette di carta con i villi corionici attaccati in un tubo etichettato da 1,5 ml.
Ridurre al minimo la quantità di salviette di carta utilizzate in questo passaggio in quanto troppo può ostruire la colonna di estrazione del DNA e di conseguenza ridurre la quantità finale di DNA raccolto. Seguire il protocollo di estrazione del DNA da un kit FFPE per eseguire l'estrazione del DNA. Utilizzando uno spettrofotometro di laboratorio, caricare 1 microlitro di DNA e misurare l'assorbanza a 216 nm per la quantificazione.
Caricare 1 microlitro di DNA su un gel di agarosio al 2% ed eseguire l'elettroforesi del gel ad una tensione da 80 a 100 volt per la valutazione qualitativa. Sulla base dei risultati della valutazione del DNA, scegli il volume di DNA da utilizzare nell'amplificazione PCR a ripetizione tandem multipla corta. Mirare a utilizzare un minimo di 1000 nanogrammi di DNA.
Procedere all'amplificazione PCR, all'elettroforesi capillare e all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per scegliere il blocco FFPE ideale, utilizzare diapositive H&E su un microscopio luminoso per selezionare un blocco FFPE che ha circa il 50-70% dei suoi tessuti composti da villi corionici. Per i blocchi che non hanno la quantità ideale di villi corionici, arricchiscono per i villi corionici man mano che viene eseguita la sezione.
Per fare ciò, identificare quale lato delle sezioni appena tagliate contiene più villi corionici in base alla corrispondente diapositiva H&E. Quindi, utilizzare una lama per tagliare l'altra metà che deve essere scartata per arricchire i villi corionici. Per eseguire la sessatura del miglior blocco FFPE possibile, tagliare quattro sezioni dello spessore di 50 micron utilizzando un microtomo.
Nel caso in cui non sia disponibile un blocco FFPE ideale, mirare a mantenere comunque il rapporto tra villi corionico e tessuto materno. Ad esempio, se solo il 30% del blocco è costituito da villi corionici, mentre il resto ha tessuti materni, rimuovere almeno la metà della sezione che contiene i tessuti materni e utilizzare più sezioni per compensare. Posizionare le sezioni in tubi etichettati da 15 ml.
Per la deparaffinizzazione e la reidratazione, lavorare in una cappa aspirante per aggiungere ogni reagente e attendere il periodo di tempo appropriato come tabulato nel protocollo di testo. Quindi, rimuovere il reagente mediante aspirazione sottovuoto con una pipetta Pasteur. Successivamente, aggiungere quattro gradi Celsius soluzione di citrato ai tubi da 15 ml.
Dopo aver posizionato in un bagno d'acqua di 80 gradi Celsius per due ore, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di citrato mediante aspirazione sottovuoto. Aggiungere sei millilitri di 1x PBS, vortice e attendere da uno a due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi sul fondo.
Se necessario, centrifugare i campioni a 1000 giri/min per 30 secondi. Rimuovere il 1X PBS per aspirazione sottovuoto. Ora aggiungi un mL di soluzione di pepsina preriscaldata e posizionalo in un bagno secco di 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Vortice ogni 10 minuti. Preparare il propidio ioduro ribonucleasi Una soluzione negli ultimi 10 minuti di questa incubazione. Aggiungere altri sei mL di 1x PBS, vortice e attendere da uno a due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi sul fondo.
Ancora una volta, rimuovere il 1x PBS per aspirazione sottovuoto. Aggiungere 550 microlitri della soluzione propidio ioduro ribonucleasi Una soluzione e posizionare i campioni in un bagno secco di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare le forcep per posizionare un pezzo di rete di filtrazione da 48 micron di cinque cm nella parte superiore dei tubi inferiori rotondi in polistirolo per l'uso con il citometro a flusso.
Filtrare la soluzione tubazione del liquido attraverso la rete e nel tubo. I campioni sono ora pronti per essere eseguiti sul citometro a flusso. Tienili avvolti in un foglio fino a quando non sono pronti per essere eseguiti.
Infine, eseguire la citometria del flusso e l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. La genotipizzazione microsatellita di una talpa idatidiforme parziale, insieme al DNA della paziente e del suo partner, rivela che la talpa della paziente è triploide dispermica. Il primo primo marcatore mostra due picchi nel prodotto del concepimento.
Il primo picco proviene dalla madre, poiché solo la madre ha un picco di queste dimensioni. Seguendo lo stesso ragionamento, il secondo picco proviene dal padre poiché condivide lo stesso allele. Si noti come il secondo picco sia molto più alto del primo, indicando che probabilmente ci sono due dosi dello stesso allele paterno in quel picco.
La contaminazione materna è molto minima in questo prodotto del concepimento perché mostra un picco molto piccolo nella posizione del secondo allele materno. Il secondo marcatore mostra tre picchi nel prodotto del concepimento. Due di queste cime provengono dal padre e una dalla madre.
Il terzo e il quarto marcatore sono simili al primo marcatore, e mostrano anche due alleli provenienti dal padre e uno dalla madre. Poiché tutti e quattro i marcatori mostrano costantemente tre alleli, due provenienti dal padre e uno dalla madre, si può concludere che questo prodotto del concepimento è triploide dispermico e conferma la diagnosi di talpa parziale. Per l'interpretazione dei risultati di genotipizzazione, è importante essere consapevoli del livello di contaminazione in base alle note prese durante le fasi di pulizia.
Per alcuni casi, non siamo in grado di giungere a una conclusione seguendo questi due metodi. In questi casi, usiamo altri metodi come FISH, per scoprire i veri genotipi. La genotipizzazione microsatellita ha permesso una diagnosi molare accurata e ha spianato la strada a comprendere meglio i genotipi associati alle varie caratteristiche delle talpe idatidiformi.
