3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione di più loci genomici all'interno di nuclei conservati per definire in modo ambiguo la loro interazione reciproca e localizzazione a livello di singola cellula. 3D multicolor DNA FISH consente lo studio diretto dell'architettura nucleare. In generale, funziona in combinazione con tecnologie basate sulla cattura cromosoma rendendo la tecnica uno strumento disponibile per la convalida dei dati C all'interno di singole cellule.
A dimostrare la procedura sarà Federica Marasca. È un postdoc nel mio laboratorio. Inizia incubando il mix di traduzione nick in un miscelatore termico a 16 gradi Celsius in base alla lunghezza del materiale del DNA iniziale.
Al termine dell'incubazione, controllare le dimensioni delle sonde su un gel di agarosio al 2,2%. Per ogni esperimento DNA FISH, precipitare la quantità appropriata di sonda in base al materiale del DNA di partenza da cui sono state prodotte le sonde in 150 microlitri di acqua distillata doppia, 20 microgrammi di DNA di sperma di salmone non etichettato, 3,5 microgrammi di DNA Cot-1 specifico per specie, tre volumi di etanolo al 100% e un 1/10° volume di tre acetati di sodio molare per un'ora a meno 80 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, centrifugare il campione alla massima velocità per un'ora a quattro gradi Celsius.
Dopo aver scartato il supernatante, lavare il pellet due volte con 500 microlitri di 70%etanolo. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare il pellet in due microlitri di formamide al 100% e agitare la sonda per 30 minuti a 40 gradi Celsius prima di aggiungere un volume uguale di citrato di sodio salino 4X nel solfato di dextran al 20%. Per il pretrattamento di fissazione e la permeabilizzazione di piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, aggiungere prima due volte 10 alla sesta cellula in 200 microlitri di PBS direttamente su coverlips di vetro in singoli pozzi di una piastra da 24 porri e lasciare che le cellule si sistemino per 30 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, sostituire rapidamente il PBS con 300 microlitri di paraformaldeide appena preparata integrata con 0,1% Tween 20. Dopo 10 minuti, lavare le celle fisse tre volte in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule T con 300 microlitri dello 0,5%TPBS per 10 minuti a temperatura ambiente prima di trattare le cellule con 250 microlitri per pozzo di cocktail RNAse diluito 1:100 in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule in 300 microlitri di PBS e aggiungere 300 microlitri di glicerolo al 20% in PBS a ciascun pozzo con un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, posizionare il bicchiere sul ghiaccio secco per 15-30 secondi per congelare le cellule prima di scongelare gradualmente i campioni a temperatura ambiente e immergerli in 300 microlitri di 20%glicerolo in PBS per 30 secondi. Dopo aver congelato/scongelato le cellule altre tre volte come appena dimostrato, lavare i campioni in 300 microlitri dello 0,5%TPBS per cinque minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi in 300 microlitri dello 0,05%TPBS per cinque minuti per lavaggio a temperatura ambiente.
Dopo l'ultimo lavaggio, trattare le cellule con 300 microlitri di acido cloridrico normale 0,1 per 12 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due risciacqui in 300 microlitri di citrato di sodio salino. Quindi fissare i campioni durante la notte in 300 microlitri di 50% formamide in citrato di sodio salino 2X a temperatura ambiente. Per la fissazione, il pretrattamento e la permeabilizzazione di grandi cellule con un'elevata quantità di citoplasma, fissare, pretrattare e permeabilizzare le cellule in modo simile a quanto dimostrato per le cellule T primarie umane e trattare i campioni con 300 microlitri dello 0,0025%pepsina in 0,01 normale acido cloridrico per alcuni secondi fino a cinque minuti.
Osservare le cellule al microscopio ottico e interrompere la reazione con due lavaggi di cinque minuti in 300 microlitri di cloruro di magnesio millimolare non appena i nuclei sono liberi dal citoplasma ma i nucleoli sono ancora visibili e intatti. Per il DNA FISH multicolore 3D, denaturare le sonde di ibridazione a 80 gradi Celsius per cinque minuti e posizionare immediatamente le sonde sul ghiaccio. Caricare le sonde su uno scivolo al microscopio pulito e posizionare un coverslip di celle su ogni goccia di sonda.
Sigillare i bordi delle coperture con cemento di gomma. Quando il cemento si è asciugato completamente, denaturare i campioni su un blocco riscaldante di 75 gradi Celsius. Dopo quattro minuti, idrizzare i campioni a 37 gradi Celsius durante la notte in una scatola metallica che galleggia in un bagno d'acqua.
La mattina dopo, staccare il cemento di gomma e con gli scivoli immersi in citrato di sodio salino 2X sollevare con cura le copertine. Posizionare ogni coverlip in singoli pozzi di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri di citrato di sodio salino fresco per pozzo per due lavaggi di cinque minuti a 37 gradi Celsius con scuotimento a 90 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, sciacquare brevemente le copertine in due millilitri dello 0,2% Tween 20 in citrato di sodio salino 4X.
Per il rilevamento 3D di DNA FISH multicolore, trasferire le coverlips in singoli pozzi di una nuova piastra da 24 porri e bloccare qualsiasi legame non specifico in 300 microlitri di tampone di blocco per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 20 giri al minuto. Al termine dell'incubazione, trattare i campioni con l'appropriata concentrazione di anti-digoxigenina e/o streptavidina diluita in tampone di blocco per 35 minuti in una camera scura e umida a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire i campioni su singoli pozzi di una piastra a sei poggiagli e lavare i campioni tre volte in due millilitri dello 0,2% Tween 20 e 4X citrato di sodio salino per cinque minuti per lavaggio con scuotimento a 90 giri al minuto.
Dopo l'ultimo lavaggio, equilibrare i campioni in due millilitri di PBS prima di trasferire le coverlips su una nuova piastra da 24 porri per il post-fissaggio in 300 microlitri di formaldeide al 2% in PBS per pozzo per due minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule fisse cinque volte brevemente in 300 microlitri di PBS, seguiti dalla colorazione con DAPI diluita a un nanogrammo per millilitro in 300 microlitri di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le coverlips altre cinque volte in PBS e montare i campioni con un mezzo di montaggio appropriato.
Quindi acquisire immagini 3D con un sistema di microscopio. 3D multicolor DNA FISH consente la visualizzazione contemporanea di diversi loci genomici all'interno di nuclei 3D conservati. Per la preparazione della sonda DEL DNA, una dimensione della sonda inferiore a 200 coppie di basi garantisce una procedura DNA FISH multicolore 3D di successo.
Le sonde SUBOPTIMAL DNA FISH prodotte dalla traduzione nick possono essere parzialmente o sovradigerite. Le sonde sovra digerite si tradurranno in un segnale non specifico a causa di una perdita di specificità nell'ibridazione e di un conseguente aumento dello sfondo. Per i linfociti T primari umani e le piccole cellule con piccoli nuclei e una bassa quantità di citoplasma, si raccomanda un normale trattamento con acido cloridrico di 12 minuti 0,1 per promuovere l'accessibilità dei nuclei alle sonde del DNA e preservare l'integrità nucleare.
La digestione della pepsina citoplasmatica non è necessaria per ottenere un segnale di DNA FISH nelle piccole cellule. Per i mioblasti e le cellule primarie umane che hanno grandi nuclei e abbondante citoplasma, tuttavia, la fase di pepsinizzazione è fondamentale. Una pepsinizzazione del citoscheletro breve e non ottimale ostacolerà l'ingresso della sonda nei nuclei terminando in assenza di un segnale FISH di DNA.
Tuttavia, se le cellule sono sovranenizzate, i nuclei non rimarranno intatti perdendo la loro struttura 3D. Un DNA FISH multicolore 3D di successo si tradurrà nella presenza di segnale all'interno dei nuclei. Suggerisco di lavorare con materiale biologico fresco, testare sonde prima di eseguire il DNA FISH multicolore 3D, preparare soluzioni fresche ed essere precisi con i tempi di incubazione e le temperature.
Ricorda che la formamide e l'HCL sono sostanze pericolose e devono sempre essere utilizzate in una cappa aspirante chimica con materiali monouso appropriati.
