L'obiettivo dei test uni ibridi del lievito potenziato è identificare l'insieme dei fattori di trascrizione che si legano a una sequenza di interesse del DNA. Il vantaggio di questa tecnica è che i test uni ibridi di lievito potenziati possono valutare più di 1000 fattori di trascrizione in un singolo esperimento. Al contrario, l'immunoprecipitazione della cromatina valuta un solo fattore di trascrizione alla volta.
Questo metodo costituisce uno strumento chiave per la genomica funzionale per identificare il repertorio dei fattori di trascrizione che si legano ai promotori e agli esaltatori genico e per identificare il legame alterato del fattore di trascrizione con varianti non codificanti. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Xing Liu un postdoc del mio laboratorio. Scongelare le piastre stock di glicerolo di lievito con l'array di prede TF sul ghiaccio.
Resuspendare il lievito utilizzando una pipetta a 12 canali e procedere al passaggio successivo entro 1 o 3 minuti. Per individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano, utilizzare un robot array ad alta densità per selezionare più piastre 96 come sorgente, 96 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti lunghi perno. I pin pad non sono riutilizzabili e devono essere scartati.
Selezionare il programma Spot Many per fare due copie per piastra di pozzo 96. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la retrointaminazione delle scorte congelate. Inoltre, selezionare l'opzione per ruotare su e giù nella sorgente per mescolare il lievito.
Seguire le istruzioni su dove e quando posizionare le piastre e consentire al robot di individuare il lievito in piastre rettangolari Sc meno triptofano. Insacca l'array maculato e incubalo lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Per generare 384 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 96 piastre di agar come fonte, 384 piastre di agar come bersaglio e 96 cuscinetti a spillo corti.
Quindi selezionare il programma single source array 1:4. In questo modo, quattro 96 tavole di colonia saranno consolidate in una piastra di colonia 384. Non utilizzare le opzioni di riciclo o rivisitazione per evitare la contaminazione tra diverse piastre.
Insacca le piastre e incuba il lato agar maculato a 384 colonie a 30 gradi Celsius per 2 giorni. Per generare 1536 array di colonie in placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 384 piastre di agar come fonte, le piastre di agar 1536 come bersaglio e 384 cuscinetti a spillo corti. Quindi selezionare il programma di origine singola del saggio 1:4.
L'obiettivo è quello di copiare ogni colonia in quattro colonie per ottenere quadruplicati. Usa le opzioni di riciclo e rivisitazione in quanto ciò comporta la copia di ogni colonia 4 volte. Segui le istruzioni del robot e consenti al robot di individuare il lievito nelle piastre prima di insaccarlo e incubare il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni.
Per amplificare l'array di colonie del 1536 in Placche rettangolari Sc meno triptofano, selezionare 1536 piastre di agar come fonte, 1536 piastre di agar come bersaglio e 1536 cuscinetti a spillo corti. Selezionare il programma Replica molti per replicare da 3 a 4 copie. Utilizzare l'opzione di riciclo e rivisitazione, ma gettare il pad quando si passa a una piastra diversa dell'array per evitare la contaminazione incrociata.
Permettete al robot di amplificare l'array di colonie 1536 in Sc meno piastre rettangolari di triptofano. Infine, insacca le piastre e incuba il lato agar maculato di 1536 colonie a 30 gradi Celsius per 3 giorni da utilizzare per i passaggi di accoppiamento. Per preparare i prati del ceppo di esche di DNA per l'accoppiamento, individuare i ceppi di esche di lievito di DNA su un piatto sc meno uracile e istidina e crescere per 3 giorni a 30 gradi Celsius.
Striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 12-16 ceppi diversi. Incubare il piatto un giorno a 30 gradi Celsius. Il giorno successivo, striare il lievito in una piastra di 15 centimetri Sc meno uracile e istidina utilizzando uno stuzzicadenti sterile in modo che ogni piastra si adatti a 4 ceppi diversi.
Incubare il piatto per un giorno a 30 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare il lievito usando uno stuzzicadenti sterile, assicurandosi di non raschiare alcun agar. Aggiungere il lievito in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di acqua sterile.
Ora aggiungi da 10 a 15 perline di vetro sterili e la sospensione del lievito su una piastra rettangolare YAPD. Agitare accuratamente in tutte le direzioni per un minuto per assicurarsi che il lievito si diffonda in tutto il piatto. Invertire immediatamente la piastra e toccare in modo che le perline vadano al coperchio.
Rimuovere e riciclare le perline. Insacca i piatti e incubali lato agar verso il basso per 1-2 giorni a 30 gradi Celsius. Quindi, procedere al passaggio di accoppiamento.
Per accoppiare l'esca di DNA del lievito e i ceppi di array TF, trasferire l'array TF su una piastra rettangolare YAPD con il robot. Selezionare la piastra di agar 1536 come sorgente e il bersaglio e il pin pad corto 1536. Selezionare il programma Replica molti.
Seleziona 4 piastre sorgente e le opzioni di riciclo e rivisitazione. Ogni piastra array TF può essere utilizzata per trasferire da 3 a 4 piastre YAPD. Le piastre array TF utilizzate per l'accoppiamento devono avere dai 2 ai 3 giorni, ma non più perché l'accoppiamento può essere inefficiente.
Per trasferire il prato di un ceppo di esche di DNA alle piastre YAPD che già contengono l'array TF, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il cuscinetto a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica molti. Utilizzare un offset casuale nella sorgente con un raggio di circa 0,6 millimetri per evitare di prendere lievito dallo stesso punto e selezionare Mix on Target per facilitare il contatto tra ceppi di lievito.
Usa il prato contenente i ceppi di esche di DNA come fonte e le piastre YAPD contenenti l'array TF maculato come bersaglio prima di insaccare le piastre e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per un giorno. Per la selezione del lievito diploide, selezionare la piastra di agar 1536 come fonte e il bersaglio e selezionare il pad a spillo corto 1536. Selezionare il programma Replica.
Selezionare Mix on Source e su Target. Lasciare che il robot trasferisca il lievito accoppiato dalle piastre YAPD alle piastre Sc meno uracile e triptofano prima di insaccarle e incubarle lato agar a 30 gradi Celsius per 2-3 giorni. Ora, seleziona le piastre di agar 1536 come fonte e il bersaglio e il pad a spillo corto 1536.
Selezionare il programma Replica. Trasferire il lievito diploide dalle piastre Sc meno uracile e triptofano alle piastre rettangolari rettangolari 3-AT e X-gal contenenti il robot. Insacca i piatti e incubali lato agar a 30 gradi Celsius per un massimo di 7 giorni.
Per i ceppi di esche di DNA con attività di reporter di alto background, scatta foto nei giorni 2, 3 e 4. Altrimenti, scatta foto ai giorni 4 e 7. Mantenere le piastre array TF a temperatura ambiente e copiare di nuovo dopo 7 giorni per un nuovo ciclo di screening.
Per illustrare il tipo di risultati che possono essere ottenuti utilizzando test uni ibridi di lievito potenziati, le regioni promotrici dei geni CCL15 e IL17F sono state schermate su una serie di 1086 TF umani. Il promotore CCL15 è un esempio di esca di DNA non autoattiva, dove le interazioni, anche deboli, possono essere facilmente rilevate. Il promotore IL17F è un esempio di esca di DNA autoattiva con attività irregolare del reporter di sfondo in cui è possibile rilevare alcune interazioni, mentre per diversi TF, non è chiaro se l'attività del reporter sia superiore allo sfondo.
Ci sono diversi problemi che possono verificarsi quando si eseguono test uni ibridi di lievito migliorati. In questo caso, le colonie sono troppo piccole e non sono riuscite a trasferirsi. In genere, circa il 95% delle colonie di prede TF mostra una crescita normale.
In questo esempio, non c'è crescita di lievito in una porzione del piatto. Questo problema è generalmente correlato a un guasto nella fase di accoppiamento se il cuscinetto a spillo 1536 non riesce a entrare in contatto con il lievito nel prato del ceppo di esche di DNA, nell'array TF o nella piastra di accoppiamento. In questi due esempi, non vengono rilevate interazioni.
Questo problema è spesso correlato a mutazioni inattivanti involontarie nei geni reporter, in particolare la LacZ, o a un'autoattività troppo elevata che maschera le interazioni. In questo caso, la piastra presenta macchie blu casuali che sono spesso correlate alla contaminazione batterica. La cosa più importante da considerare è una corretta preparazione della piastra.
Assicurarsi che tutti i componenti siano aggiunti e che l'altezza dell'agar sia uniforme poiché tutti i passaggi successivi dipendono da questo. Sebbene la maggior parte dei reagenti non sia pericolosa, è importante indossare i guanti in ogni momento per evitare la contaminazione dei campioni e delle piastre. Come per qualsiasi saggio di legame del DNA, è importante convalidare le interazioni identificate utilizzando saggi funzionali come test dei reporter, knockdown del fattore di trascrizione o knockout, seguiti dalla misurazione dell'espressione del gene bersaglio.
Questo metodo ha permesso l'identificazione di fattori di trascrizione che regolano i geni coinvolti in particolari processi biologici e fattori di trascrizione con legame alternativo a varianti associate a malattie non codificanti.
