Il nostro protocollo è compatibile con altri metodi di analisi molecolare e consente la valutazione di come i farmaci influenzano la vitalità delle fette di tessuto in tatto e le prestazioni dello screening della produttività media. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo misurare la vitalità di un'intera fetta di tessuto in tempo reale con pochissima pre-o post-elaborazione. Questa tecnica accelera lo sviluppo precli clinicalo dei farmaci e l'oncologia testando i candidati ai farmaci o le fette di tessuto acquisite direttamente dai campioni di tessuto tumorale del paziente.
Il nostro metodo di valutazione della fattibilità tissutale in tempo reale è piuttosto versatile e può essere applicato agli studi di biologia del cancro, neuroscienze e biologia dello sviluppo. Preparare fette di tessuto vitali in tatto è la chiave per il successo della procedura. Le impostazioni del Vibratome in composizione media devono essere regolate in base al tipo di tessuto e alla compattezza.
Il giorno dell'acquisizione della fetta di tessuto tumorale, aliquote 250 microlitri di mezzo di coltura di fette tissutali per pozzo in una piastra di 24 pozza e posizionare un inserto di coltura tissutale in ogni pozzo. Quindi posizionare la piastra in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica fino all'uso. Per acquisire frammenti di tessuto tumorale, immergere il tessuto tumorale in HBSS ghiacciato in una piastra di coltura di 10 centimetri e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto a metà.
Utilizzare un punzone di biopsia di sei millimetri per acquisire cilindri del tessuto tumorale e tagliare un'estremità di ogni cilindro per creare una superficie piana. Posizionare i pezzi di tessuto in HBSS fresco e ghiacciato e accendere un vibratomo. Disinfettare tutte le apparecchiature con il settanta per cento di etanolo e posizionare il vassoio tampone Vibratome, coperto da un coperchio di vetro acrilico, al centro del bagno di ghiaccio Vibratome.
Aggiungere ghiaccio al bagno, riempire il vassoio tampone con HBSS freddo. Caricare una lama di rasoio nel supporto della lama e utilizzare le forcep denate per selezionare attentamente un campione di tumore perforato da biopsia. Aggiungere una goccia di colla cianoacrilato di grado medico sulla piastra del campione.
Tamponare il tessuto su un pezzo di tovagliolo di carta privo di pelucchi per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso e montare il cilindro del tessuto sulla goccia in posizione stabile eretta. Dopo due o tre minuti di asciugatura ad aria, posizionare la piastra nel vassoio tampone e aggiungere ulteriore HBSS al vassoio fino a quando il tessuto non è completamente immerso nel tampone. Quindi assemblare il Vibratome posizionando il vassoio del ghiaccio e l'assemblaggio del vassoio tampone sul Vibratome e bloccando il braccio.
Impostare lo spessore di taglio vibratome su 250 micrometri, l'ampiezza a tre millimetri, la velocità di affezione a 0,01-0,25 millimetri al secondo e l'angolo della lama a 15-21 gradi. Impostare le posizioni iniziale e finale della lama e regolare l'altezza del palco. Eseguire lo strumento in modalità continua per tagliare le fette per diversi cicli fino a quando i tessuti non vengono tagliati uniformemente.
Utilizzare un ampio trasferimento di punta bipede per trasferire le fette e una piccola quantità di HBSS in singoli inserti di coltura cellulare in ogni pozza della piastra da 24 pozzali precedentemente preparata e utilizzare un trasferimento di punta fine bipede per rimuovere qualsiasi buffer in eccesso dai pozzi. Una volta raggiunta la fine del campione, montare un nuovo pezzo di tessuto e ottenere fette aggiuntive fino a quando non sono stati acquisiti campioni sufficienti. Quindi coltura le fette di tessuto nell'incubatrice di coltura cellulare per 24-48 ore.
Per misurare la vitalità delle fette di tessuto, preparare un reagente di misurazione della vitalità a base di luminescenza contenente luciferasi e prostrato a una o mille diluizioni nel mezzo di coltura di fette di tessuto fresco secondo le istruzioni del produttore e sostituire il mezzo in ogni pozzo della piastra del pozzo 24 con la miscela. Aggiungere 50 microlitri di miscela di substrato enzimatico su ogni fetta di tessuto e posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno di un incubatore umidificato con agitazione delicata a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al cinque per cento durante la notte. La mattina seguente, misurare il segnale di luminescenza in ogni pozzo su un lettore di micropiatte utilizzando le impostazioni appropriate.
Dopo aver determinato la vitalità di base delle fette di tessuto, sciogliere i farmaci di interesse nel mezzo di coltura delle fette di tessuto per ottenere soluzioni di stock 10x e aggiungere ogni soluzione di farmaco 10x al mezzo di coltura nella parte inferiore di ogni fetta di tessuto bene. Trasferire 50 microlitri del farmaco integrato dal fondo di ogni pozzo su ogni fetta di tessuto e riportare le fette allo shaker orbitale durante la notte. La mattina seguente, trasferire la piastra di coltura all'incubatore di sottocultura senza scuotere e misurare l'intensità luminescente in ogni campione di tessuto sul lettore di micropiastrine nei punti di tempo sperimentali appropriati.
La vitalità dei tessuti tumorali trattati in ogni momento può quindi essere calcolata utilizzando l'equazione come indicato. La vitalità delle fette di tessuto preparate da un campione di tumore al seno del topo può essere mantenuta per almeno 21 giorni con scambi medi occasionali. Il trattamento con l'inibitore della multichinasi per quattro giorni riduce l'intensità del segnale di luminescenza di 100 volte rispetto ai tessuti tumorali di controllo trattati con solfossido di dimetile.
Il trattamento con metà della concentrazione dello stesso inibitore diminuisce la luminescenza già dal primo giorno e raggiunge il livello più basso al quarto giorno, rimanendo basso per ogni successivo punto di tempo misurato. Al contrario, l'intensità luminescente del gruppo controllato del tessuto tumorale rimane stabile per tutta la coltura di sei giorni. Inoltre, il trattamento delle fette tumorali del cancro al seno del topo con dosi seriali dell'inibitore per quattro giorni illustra i cambiamenti dose-dipendenti nella vitalità della fetta nella concentrazione efficace mezzo massima del farmaco.
Anche gli xenoinnesti derivati dal paziente trattati con doxorubicina, un farmaco chemioterapico standard, mostrano cambiamenti di vitalità dose-dipendenti. Inoltre, il test di diciassette farmaci preclitici e clinicamente approvati in triplice copia su fette di tessuto preparate da un singolo xenograft derivato dal paziente sfuso fornisce la prova del concetto che lo screening del farmaco a media produttività può essere eseguito su fette tumorali con il microambiente tumorale nativo. Quando si preparano i campioni di tessuto tumorale, fare attenzione a ridurre al minimo il contatto con le fette di tessuto per evitare di danneggiare il tessuto.
Il nostro metodo può essere accoppiato con altri approcci come IHC, citometria a flusso o sequenziamento a singola cellula, per ottenere informazioni spaziali e uni-cellule dai tessuti. La nostra tecnica consente di testare gli effetti di più farmaci di interesse a varie dosi in condizioni fisiologiche nel tempo. Quando si preparano fette di tessuto da tumori con uno stato patogeno sconosciuto, assicurarsi di eseguire tutte le procedure in un armadietto di biosicurezza.
