L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure coinvolte nella definizione di un modello sintomatico e farmacologico del topo per la distonia DYT /PARK-ATP1A3 utilizzando cannule cerebrali nelle pompe osmotiche e inducendo stress attraverso compiti motori impegnativi. Questo metodo descrive in dettaglio come stabilire un modello di topo farmacologico utilizzando la somministrazione cronica di farmaci tramite pompe osmotiche a più cannule cerebrali e come indurre il fenotipo attraverso compiti motori impegnativi. Il paradigma dello stress motorio lieve fornisce anche approfondimenti sul ruolo delle interazioni gene-ambientali nei disturbi del movimento e può essere applicato ad altri modelli di roditori.
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Inizia preparando le pompe osmotiche in un ambiente sterile. In primo luogo, riempire una siringa da un millilitro con una cannula di riempimento calibro 27 con soluzione di ouabain filtrata sterile o soluzione per veicoli.
Tenere la pompa osmotica in posizione verticale, inserire la cannula fino alla pompa e riempire lentamente il serbatoio fino a quando la soluzione in eccesso appare in cima. Quindi, inserire il moderatore di flusso nella pompa. Togliere con cura la flangia bianca del moderatore di flusso con le forbici e collegare un pezzo di tubi in vinile al moderatore del flusso.
Immergere ogni pompa in tubi Eppendorf riempiti a metà della soluzione salina e metterli in un termociclo di 37 gradi per garantire che la velocità di pompaggio raggiunga uno stato stazionario prima di iniziare l'intervento chirurgico. Dopo che l'animale è stato profondamente anestetizzato secondo protocolli approvati, posizionare l'animale in un telaio stereotattico e fissare la testa usando punte di gomma o barre dell'orecchio non rotture. Dopo un'accurata disinfezione dell'area chirurgica, utilizzare un bisturi per posizionare l'incisione nella parte superiore della testa e utilizzare le forbici per continuare l'incisione fino agli arti anteriori.
Esporre il cranio con l'aiuto di morsetti bulldog e pulire il periostio con un applicatore sterile con punta di cotone. Allineare una penna o la punta di una cannular macchiata di inchiostro nero con bregma e utilizzare le coordinate appropriate per contrassegnare i tre punti di ingresso per le cannule cerebrali sul cranio. Successivamente, praticare con cura i fori per il doppio cannolo designato per i gangli basali e la singola cannula designata per il cervelletto.
Praticare un quarto foro per una piccola vite tra lo striato e il cervelletto. Questa vite sarà infine incorporata nel cemento dentale e fornirà una presa aggiuntiva per le cannule. Al fine di creare una piccola tasca per la pompa osmotica su ciascun lato degli animali indietro, utilizzare le forcelle tissutali per separare gli strati di tessuto sottocutaneo.
Avanzare le forcep verso una gamba posteriore e aprire leggermente le forcep per allargare la tasca sottocutanea. Ripetere la stessa procedura per l'altro lato, prima rimuovendo le forcep dall'incisione e quindi spingendole delicatamente verso la seconda gamba posteriore. Con l'aiuto di forcep, inserire con cura le pompe e il catetere collegato in ogni tasca sottocutanea.
La tasca dovrebbe consentire alla pompa di scivolare facilmente. Utilizzando un mini portapompa, introdurre una singola cannula osmotica con una lunghezza personalizzata di 3,0 millimetri nel foro praticato nella linea mediana del cervelletto. Staccare attentamente la testa di cannula e fissare la cannula e la piccola vite con cemento dentale, facendo attenzione a non coprire il pezzo di collegamento per il tubo della pompa osmotica.
Assicurarsi che il cemento del dentista che circonda la cannula si sia completamente asciugato prima di continuare con l'intervento chirurgico. Prima di inserire la doppia cannula nei fori praticati bilateralmente sopra i gangli basali, attaccare due pezzi di tubi in vinile lunghi 0,5 centimetri ai due pezzi di collegamento della doppia cannula. Collegare i tubi in vinile con un adattatore biforcazione e precomporre con cura l'intero sistema di tubi con soluzione o veicolo a ouabain sterile.
Quindi, ripetere gli stessi passaggi mostrati in precedenza per la cannula singola e terminare fissando la doppia cannula con cemento dentale. Collegare i cateteri delle pompe osmotiche rispettivamente all'adattatore di biforcazione e a una singola cannula. Entrambe le pompe hanno una portata uguale, quindi fare attenzione a collegare la pompa osmotica con una doppia soluzione concentrata all'adattatore di biforcazione per garantire che la stessa concentrazione raggiunga sia i gangli basali che il cervelletto.
Chiudere l'incisione sul retro degli animali con punti per quanto possibile senza allungare eccessivamente la pelle. Iniettare per via sottocutanea una soluzione salina sterile, che dovrebbe avere la temperatura corporea per evitare la disidratazione. Rimuovere l'animale dal telaio stereotattico e posizionarelo nella gabbia di recupero.
Al fine di indurre movimenti simili alla distonia, i topi perfusi di ouabaina dovrebbero essere esposti a compiti motori impegnativi come paradigma di stress lieve quattro ore dopo l'intervento chirurgico e ripetutamente ogni 24 ore dopo. Questo non include una caratterizzazione comportamentale degli animali. Dimostriamo qui l'esempio di un animale perfuso dal veicolo, che viene posizionato su un palo di legno di superficie ruvida di 50 centimetri, naso rivolto verso il basso.
Fornire una biancheria da letto sufficiente alla base del palo in caso di cadute. Per i topi perfusi di ouabain, gli animali dovrebbero iniziare a presentare i primi sintomi come la bradicinesia quattro ore dopo l'intervento chirurgico. Tuttavia, 24 ore dopo l'intervento chirurgico, dovresti vedere l'iperestensione involontaria degli arti anteriori o posteriori come un segno di movimenti simili alla distonia durante la discesa.
I topi dovrebbero scendere il palo tre volte, consentire almeno due minuti di recupero tra ogni discesa. Il tempo di discesa non deve essere misurato. La prova del palo deve essere seguita da un secondo compito del motore, utilizzando un'asta rotante.
Come per il test delle prestazioni rotarod, l'ouabain e i topi perfusi dal veicolo dei gruppi di stress vengono posizionati sull'asta rotante. La latenza a cadere non deve essere misurata. Come fatto per il test precedente, i topi devono essere posizionati sull'asta rotante tre volte, consentendo due minuti di recupero tra una serie e l'altra.
La scala di classificazione della distonia modificata può essere utilizzata per valutare la frequenza, la gravità e la distribuzione corporea dei movimenti simili alla distonia dei topi. Gli animali devono essere collocati in una scatola di plastica o di legno e i movimenti devono essere registrati per un periodo di tempo di quattro minuti. I tassi devono essere accecati dall'assegnazione del gruppo.
Movimenti o posture considerati simili alla distonia sono l'iperestensione involontaria degli arti anteriori, una posizione ampia o l'iperestensione degli arti posteriori, così come la cifosi. Se solo una parte del corpo è interessata, la distonia deve essere considerata focale. Se il tronco e almeno altre due parti del corpo sono colpite, la distonia deve essere considerata generalizzata.
Un secondo sistema di punteggio di nuova sviluppo da zero a otto punti, valuta la presenza e la gravità dei movimenti simili alla distonia durante un test di sospensione della coda. Per il test, tenere il mouse vicino alla coda vicino alla sua base per due minuti. Si consiglia di registrare il test di sospensione della coda e assegnare un punteggio all'analisi successiva del metraggio.
Gli arti anteriori sono segnati da zero a quattro punti. Le retrazioni toniche ripetute o sostenute di uno degli arti anteriori, così come l'iperestensione combinata con l'incrocio degli arti anteriori sono segnati come distonia. Movimenti simili alla distonia degli arti posteriori, che significa retrazione e stringe, così come iperestensione sostenuta, sono segnati da zero a tre punti.
Una distorsione tronca presente oltre l'80% del tempo registrato viene segnata con un punto aggiuntivo. La chiusura degli arti posteriori è un segno non specifico per la compromissione motoria e non deve essere segnata. Questo grafico mostra i risultati della scala di valutazione della distonia.
I topi stressati perfusi di ouabain presentano movimenti significativamente più simili alla distonia in un periodo osservazionale di 72 ore rispetto al gruppo perfuso di ouabain non stressato, così come agli animali del veicolo. Questa immagine mostra i risultati del test di sospensione della coda e mostra un risultato simile alla scala di classificazione della distonia. Si noti che i risultati della media dal punteggio totale di ogni animale per ogni punto di tempo.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare stereotassicamente più cannule cerebrali e come impiantare per via sottocutanea pompe osmotiche. Il vantaggio principale di questo metodo è che le iniezioni ripetitive e stressanti possono essere evitate e che un substrato come l'ouabain, che altrimenti avrebbe effetti collaterali a livello di sistema, può essere consegnato direttamente a una specifica struttura cerebrale.
