Questo protocollo genera un nuovo modello per l'epilessia del lobo temporale in cui i topi hanno sviluppato convulsioni spontanee, ed è stato molto utile per sondare i meccanismi dell'epilettogenesi e anche per lo screening di nuove terapie. Questa procedura nei topi VGAT-Cre porta in modo affidabile a crisi elettrografiche e composite motorie e motorie spontanee ricorrenti senza causare un'estesa morte delle cellule ippocampali che si osserva spesso dopo lo stato epilettico innescato con chemioconvulsivanti o stimolazione elettrica continua. Per iniziare a realizzare cuffie, tagliare un filo di acciaio inossidabile rivestito di politetrafluoroetilene lungo 3,5 centimetri e rimuovere circa un millimetro del rivestimento isolante da entrambe le estremità del filo.
Metti due perni su un supporto per morsa, con la parte inferiore del perno con una fessura più lunga rivolta verso il basso. Quindi, applicare il flusso sulle estremità spogliate del filo e sulle parti superiori dei perni. Tappare la parte spogliata del filo e la parte superiore dei perni con una saldatura sufficiente a rivestirla senza traboccare sui lati.
Posizionare una delle estremità spogliate del filo nel perno il più profondamente possibile mentre la saldatura si sta sciogliendo. Ripetete il processo per il secondo perno con l'altra estremità spogliata del filo. Dopo aver raffreddato i perni e saldato per 10 secondi, rimuovere i perni dal supporto della morsa e quindi tirare sui perni per assicurarsi che la connessione tra il filo e i perni sia forte e tieni.
Risciacquare i perni in acqua fredda seguita da asciugatura. Successivamente, utilizzare un ohmmetro per verificare la conduttanza tra il pin uno e il pin due. Portare i perni all'estremità del filo insieme per tenerli paralleli e vicini.
Morsetti un emostatico al centro del filo e ruota l'emostatico per torcere saldamente il filo su se stesso. Dopo aver rimosso l'emostato, bloccare le pinze sul filo intrecciato a due millimetri sotto i perni per piegare il filo a 90 gradi. Spingere il filo di 90 gradi indietro sopra la pinza, creando un'altra curva a un millimetro dalla prima.
Usa piccole forbici affilate per tagliare il filo intrecciato a 45 gradi e 3,5 millimetri sotto la curva. Preparare due elettrodi intrecciati bipolari o a doppio pin per ciascuna cuffia. Per preparare un elettrodo di riferimento, tagliare un filo con perno saldato su entrambe le estremità in due.
Quindi, tagliare il filo a sette millimetri e piegare l'estremità del filo a un millimetro sotto la punta. Coprire la punta piegata di un millimetro del filo con una pinza e ruotare il filo stretto attorno alla pinza per creare un piccolo anello con un millimetro di diametro. Quindi, piegare l'anello perpendicolarmente alla parte diritta del filo per far sì che la punta del filo punti di nuovo verso l'esterno.
Assemblare tutti gli elettrodi nel piedistallo a sei pin fianco a fianco con una distanza di sei millimetri tra i due elettrodi bipolari. Posizionare l'elettrodo di riferimento nel foro esterno centrale. Prima di procedere con l'intervento chirurgico, registrare il peso dei topi VGAT-Cre di otto settimane.
Quindi, posizionare l'animale in una camera di induzione per indurre l'anestesia. Posizionare il mouse anestetizzato su una piastra elettrica a 37 gradi Celsius. Se si utilizza un sistema di temperatura controllato da feedback, inserire la sonda di temperatura nel retto dell'animale per il monitoraggio della temperatura durante l'intervento chirurgico.
Per iniziare l'intervento chirurgico, reindirizzare il flusso di anestesia inalante al cono del naso e montare l'animale nella cornice stereotassica posizionando delicatamente i denti superiori anteriori nella barra incisiva e spostare il cono sul naso. Quindi, posizionare le barre auricolari nelle orecchie e fissarle al telaio stereotassico. Assicurarsi che la testa dell'animale sia livellata e centrata e non possa essere spostata quando leggermente sondata.
Una volta montato l'animale, iniettare 0,5 millilitri di Normosol sui topi per l'idratazione e applicare lubrificante oculare per prevenire l'essiccazione corneale. Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando una zampa dell'arto posteriore. Se il riflesso di astinenza è assente nell'animale, procedere alla rimozione dei peli del cuoio capelluto del topo intorno all'area chirurgica.
Al termine, disinfettare tre volte l'area della pelle pulita con un'applicazione alternata di etanolo e iodio, finendo con iodio, e iniettare 0,05 millilitri di 0,25% di bupivacaina per via sottocutanea. Fai un'incisione sul cranio usando un bisturi e poi taglia una parte della pelle con le forbici chirurgiche, esponendo il cranio. Spingere la pelle da parte prima di pulire il cranio da tutti i tessuti sottostanti con un batuffolo di cotone.
Pulire il cranio con perossido di idrogeno usando tamponi di cotone sterili e rendere visibili le suture del cranio, il bregma e la lambda. Con il trapano montato stereotassialmente, spostare la punta del trapano sul bregma in coordinate X, Y e Z zero. Quindi, sollevare e spostare il trapano su lambda per determinarne le coordinate per determinare se la testa è livellata.
Dopo aver asciugato accuratamente il cranio, applicare una goccia di adesivo dentale autoincisivo con l'applicatore. Attendere 60 secondi prima di polimerizzare l'adesivo dentale con una luce UV dentale per 40 secondi. Una superficie lucida indica che l'adesivo è stato efficacemente reticolato con il cranio.
Con l'aiuto di una punta da 0,031 pollici, praticare con cura due fori di bava bilateralmente nel cranio a 5.000 rotazioni al minuto, o RPM, evitando di perforare il cervello. Applicare una goccia di soluzione salina per migliorare la perforazione dei fori di bava. Per l'impianto di elettrodi di profondità dell'ippocampo, praticare tre millimetri posteriormente e tre millimetri lateralmente dal bregma.
Praticare un foro di bava per l'elettrodo di riferimento sopra il cervelletto dietro la lambda a sei millimetri posteriormente e zero millimetri lateralmente dal bregma. Quindi, montare il piedistallo a sei pin con elettrodi assemblati nel supporto dell'elettrodo sul telaio stereotassico. Allineando gli elettrodi sopra i fori di bava corrispondenti, abbassa lentamente e naviga l'auricolare per individuare le due punte degli elettrodi bipolari proprio sopra i fori dell'ippocampo sinistro e destro e, se necessario, regolare l'elettrodo di riferimento per passare sopra il foro sopra il cervelletto.
Quando gli elettrodi di torsione dell'ippocampo sono proprio sopra i fori, azzerare l'asse Z e abbassare lentamente l'elettrodo a meno tre millimetri nell'ippocampo destro e sinistro e guidare l'elettrodo di riferimento nel foro sopra il cervelletto. Preparare il cemento dentale mescolando la polvere e il liquido in una ciotola. Quindi, coprire la superficie del cranio, gli elettrodi e lo spazio tra la superficie del cranio e il fondo del piedistallo con cemento dentale.
Una volta che il cemento si asciuga e si indurisce, staccare il supporto dell'elettrodo dal braccio stereotassico, sollevare il braccio e rimuovere il supporto dal piedistallo. Dopo aver somministrato il topo per via sottocutanea con ketoprofene e Normosol, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico per spostare l'animale sul pad riscaldato nella gabbia del vivaio. Una volta completamente sveglio, riportare il singolo animale nella gabbia del vivaio, nutrirlo con cibo morbido e monitorare la perdita di peso ogni giorno fino a 72 ore dopo l'intervento.
Nel grafico rappresentativo del violino, viene mostrato il numero di stimolazioni richieste dai topi al criterio dello stato acceso. I topi in genere hanno raggiunto lo stato acceso o sperimentano cinque crisi motorie tonico-cloniche bilaterali dopo 15 stimolazioni. La latenza alle crisi ricorrenti spontanee, o SRS, è risultata essere di 10,7 e la frequenza media delle crisi è stata di 1,3 crisi al giorno.
L'affidabile distribuzione SRS ha mostrato che i topi erano epilettici per circa 23 giorni. Nelle immagini rappresentative, si può vedere il numero di neuroni anti-NeuN positivi o morti neuronali in vari sottocampi dell'ippocampo e della corteccia entorinale. È importante che i due elettrodi bipolari entrino uniformemente nei due fori di bava, quindi devono essere proprio sopra i fori di bava.
Inoltre, è importante applicare con attenzione il cemento dentale e lasciarlo indurire completamente prima di rimuovere il supporto dell'elettrodo. Questa tecnica ci consente di generare topi epilettici e monitorarli continuamente con la registrazione EEG e anche la registrazione video, contemporaneamente. E con gli esperimenti che facciamo, possiamo quindi testare nuove strategie di trattamento come la terapia genica per ridurre la frequenza, la durata e la gravità delle crisi.
