L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare importanti aspetti chiave della funzione della ligasi E3, tra cui la specificità dell'enzima E2, la selezione del substrato e il trasferimento dell'ubiquitina. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua ampia applicabilità, in quanto le proteine provenienti da tutte le fonti eucariotiche possono essere espresse in modo ricombinante e studiate in vitro senza la necessità di attrezzature speciali. Quando si utilizza la tecnica di scarica di lisina per la prima volta, è importante ottimizzare i parametri di analisi, come le concentrazioni enzimatiche, per identificare le condizioni di scarico ideali per la ligasi E3 scelta.
Per eseguire un test di auto-ubiquitilazione in vitro, impostare uno schema di pipettaggio per testare la capacità funzionale di diversi enzimi E2 e preparare una miscela master su ghiaccio per tutte le reazioni di ubiquitilazione più una reazione aggiuntiva. Quindi, aggiungere un micromolare di enzimi E2 alle provette appropriate e incubare i campioni in un termociclatore PCR per due ore nelle condizioni indicate. Dopo l'incubazione, aggiungere il tampone campione SDS a ciascuna reazione e mescolare mediante pipettaggio più volte.
Quindi far bollire immediatamente i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti e conservare le proteine denaturate a 20 gradi Celsius. Per eseguire un test di ubiquitilazione del substrato in vitro, preparare lo schema di pipettaggio per tutte le reazioni. Dopo aver calcolato la quantità di miscela principale necessaria per una reazione, preparare la miscela principale per tutte le reazioni su ghiaccio e aggiungere la miscela principale a ciascun tubo.
Aggiungere le rispettive ligasi E3 singolarmente. Quindi incubare i campioni nel termociclatore PCR per due ore come dimostrato. Alla fine dell'incubazione, aggiungere due volte tampone campione SDS a ciascuna reazione, mescolare più volte mediante pipettaggio e far bollire i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius.
Per eseguire un test di scarica di lisina, impostare lo schema di pipettaggio per la reazione di carica e incubare le reazioni di carica per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Per fermare la reazione di carica, aggiungere l'apirasi a una concentrazione finale di 1,8 unità per millilitro e incubare la reazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 30 millimolari e utilizzare acqua a doppia distillazione per regolare il volume della reazione a 30 microlitri.
Per scaricare l'ubiquitilazione E2 tramite E3, impostare cinque tubi corrispondenti ai punti temporali per l'esperimento, aggiungere 6,7 microlitri di tampone campione non riducente a ciascun tubo, rimuovere sei microlitri della reazione di carica interrotta dal tubo zero del punto temporale e regolare il volume totale a 26,7 microlitri. Per impostare le reazioni di scarica, aggiungere acqua a doppio distillato, tampone di ubiquitilazione, BSA, lisina, E3 ligasi e E2 caricato a ciascuna reazione. Dopo i periodi di tempo selezionati, trasferire campioni da 20 microlitri da ciascuna reazione di scarica alla provetta del campione corrispondente.
Quindi ruotare immediatamente i campioni e posizionarli a 70 gradi Celsius per 10 minuti. In questa analisi rappresentativa di Western blot, il CHIP inattivo non era auto-ubiquitilato. Tuttavia, i prodotti di ubiquitina indipendenti da E3 sono stati formati in presenza di CHIP inattivo e in assenza di CHIP.
Il CHIP wild-type è stato auto-ubiquitilato quando combinato con le proteine delle famiglie UBE2D e UBE2E, mentre le catene di poliubiquitina libera sono state prodotte in cooperazione con le proteine della famiglia UBE2D ma non con le proteine della famiglia UBE2E. Il legame dell'ubiquitina da parte di UBE2N/V1 ha diretto la formazione di catene di ubiquitina libere. L'auto-ubiquitilazione e l'ubiquitilazione di UNC-45B sono state osservate con CHIP wild-type ma non con il mutante inattivo di CHIP, indicando che UNC-45B agisce come substrato conservato per CHIP.
Quando l'attività catalitica di CHIP è stata analizzata utilizzando un test di scarica di lisina, l'enzima UBE2D2 non caricato aveva un peso molecolare di 17 kilodalton e l'UBE2D2 caricato con una singola molecola di ubiquitina aveva un peso molecolare di circa 26 kilodalton. Al tempo 0, è stata osservata l'intera resa E2 carica. In presenza di CHIP inattivo, è stata rilevata una debole scarica E3 ligasi-indipendente di UBE2D2 ma non auto-ubiquitilazione di CHIP.
In presenza di CHIP wild-type, lo scarico di UBE2D2 è stato rapido e completato entro 60 minuti, e l'auto-ubiquitilazione di CHIP ha indicato un trasferimento di ubiquitina sui propri residui di lisina. A causa della limitata capacità di E2, lavorare il più rapidamente possibile e procedere immediatamente con la reazione di scarica seguita da SDS-PAGE e Western blotting. Seguendo questi protocolli di ubiquitilazione in vitro, i tipi specifici di legame di ubiquitilazione possono essere identificati sondando le macchie occidentali con anticorpi specifici del linkage.
