Questo lavoro è stato supportato da The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) e l&#39;Istituto scozzese per la segnalazione cellulare (ora parte della proteina fosforilazione MRC e l&#39;unità ubiquitylation).

1. Assay Fase di sviluppo Nota: prima di iniziare la schermata siRNA, una fase di sviluppo di analisi è fondamentale per impostare i parametri importanti per lo screening con la linea cellulare giornalista. È essenziale investire sforzo significativo in questa fase, questo sosterrà il futuro successo della schermata. <ol><li> Per caratterizzare l&#39;ipossia-reattività del U20S-HRE linea cellulare giornalista, crescere 2 x 75 cm 2 flaconi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% FBS. </li><li> Aspirare il supporto da un pallone di cellule, lavate due volte con 10 ml di PBS e staccare cellule aggiungendo 2 ml di 0,05% soluzione di tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 5 min. Risospendere le cellule in 8 ml DMEM 10% FBS e pipetta su e giù per creare una sospensione cellulare omogenea. </li><li> Pipettare 20 ml di sospensione ad una camera di conteggio delle cellule, in duplicato, e inserire la camera in un cou cella automatizzatanter. Fare clic su &quot;Visualizza immagine&quot; sul software bancone cellulare e assicurarsi che le cellule sono a fuoco. Fare clic su &quot;Count&quot; e prendere nota della densità cellulare. Ripetere questa operazione per l&#39;altro duplicato e calcolare la densità media cella. Diluire le cellule con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 60.000 cellule / ml. </li><li> Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml (6.000 cellule) delle cellule diluite agli stessi tre colonne (ad es A5-H5, H6 e A6-A7-H7), della 5 a 96 pozzetti piastre sterili bianche pareti saggio, e il trasferimento di un umidificata 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 durante la notte. Nota: queste piastre saranno utilizzati per determinare la potenza luciferasi ipossia-dipendente per una serie di esposizioni ipossia: 0 ore, 2 ore, 6 ore, 10 ore e 24 ore. </li><li> Alla fine del giorno seguente, nota del tempo e aggiungere la piastra ipossia 24 ore al set workstation ipossia al 1% di ossigeno. La mattina seguente, calcolare il tempo di 10 ore, 6 ore e 2 ore prima della piastra di 24 ore è dovuto essere rimosso from la workstation ipossia. In questi momenti, aggiungere 10 ore, 6 ore e 2 piastre hr alla workstation ipossia. </li><li> Preparare 30 ml di 2x combinato tampone di luciferasi lisi / dosaggio (50 mM Tris fosfato pH 7.8, 16 mM MgCl 2, 2 mM DTT, 2% Triton-X-100, il 30% di glicerolo, 1 mM ATP, 1% BSA, 0,25 mm luciferina e 8 mM Na 4 P 2 O 7). Nota: aggiungere i componenti nell&#39;ordine indicato e permettere la BSA almeno 30 minuti per sciogliere prima dell&#39;aggiunta di luciferina e Na 4 P 2 O 7. </li><li> Rimuovere tutte le piastre dalla workstation ipossia al momento opportuno. Aggiungere 100 ml di 2x tampone di luciferasi lisi / dosaggio nei rispettivi pozzetti della piastra di analisi e coprire con pellicola trasparente. Agitare le piastre su un agitatore per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente. </li><li> Trasferire lo stack piastra per un sistema automatico 96 e scolapiatti luminometro. Sotto il menu &quot;Protocolli&quot;, selezionare &quot;abs 595&quot; ed evidenziare tutti welLS da leggere nella piastra mappa su schermo sotto il menu &quot;bene di selezione&quot;. Fare clic su &quot;run&quot; per misurare la luminescenza di ogni bene quindi calcolare il valore medio di ogni piatto. Calcolare l&#39;ipossia-dipendente fold-aumento dell&#39;attività giornalista dividendo il valore medio di ogni piatto ipossia dalla lettura media del normoxia (0 hr ipossia) piastra di controllo. Nota: è essenziale osservare una robusta risposta luciferasi ipossia-dipendente per essere adatto per lo screening. Un metro e ottanta volte maggiore nell&#39;attività giornalista è considerato eccellente. </li><li> Creare una piastra di controllo master che contiene quattro elevato controllo (HIF1a siRNA) replicati (pozzi A1-D1), quattro basso controllo (FIH1 siRNA) replica (pozzi A12-D12), quattro buffer di controllare solo repliche (pozzi E1-H1) e quattro replicati non bersaglio controllo siRNA (E12-H12), dove tutte le piscine siRNA sono ad una concentrazione di 200 nM. Nota: i controlli alti e bassi sono stabiliti sulla base di regolatori di via noti che aumentano e Decrfacilitare la risposta all&#39;ipossia, rispettivamente. In alternativa, lo sviluppo di analisi utilizzando un sottoinsieme della libreria può essere utilizzato per identificare un adeguato controllo. </li><li> Usando una pipetta multicanale, trasferire 10 ml di ogni siRNA controllo per un piatto bianco test murato sterile. Preparare mix trasfezione di 0,1 microlitri di reagente di trasfezione in 10 microlitri di medio-siero ridotta (1:100) per bene, e il trasferimento di 10 ml di miscela di trasfezione ad ogni controllo bene. Pipetta su e giù brevemente per mescolare e lasciare la piastra a riposo per 20-60 minuti per consentire trasfezione formazione del complesso. </li><li> Preparare una sospensione cellulare di 75.000 cellule / ml con il secondo pallone di cellule U20S-HRE. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 80 ml (6.000 cellule) della sospensione di cellule per ogni miscela di trasfezione. Trasferire la piastra ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore, quindi trasferirli su una workstation ipossia per altre 24 ore ed eseguire saggi di luciferasi come descritto ai punti 1.6-1.8. </li><li> Calcolare il Z-factor per i controlli di alti e bassi con la formula Z = 1 - [3 x (deviazione standard elevato controllo + deviazione standard di controllo basso) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)]. Nota: un valore compreso fra 0,5-1 indica un saggio eccellente e dovrebbe essere adoperata per. </li></ol> 2. Schermata Principale Nota: una volta che queste condizioni di base dalla fase di sviluppo di analisi sono in atto, la schermata principale può essere eseguita in triplicato in 96 formato micropiastre utilizzando il seguente protocollo. <ol><li> Grow 7 x 75 cm 2 fiaschi di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino (FCS). Nota: I seguenti passaggi 2,2-2,13 devono essere effettuate il giorno 1. </li><li> Avviare la replica 1 preparando una piastra di controllo master contenente 200 ml di ogni controllo come descritto al punto 1.9 e lo scongelamento una serie di diluizioni del siRNA ubiquitome library per un minimo di 30 min. Nota: ogni pozzetto contiene un pool di 4 siRNA assemblate in 17 piastre x 96 pozzetti con colonne 1 e 12, lasciato vuoto per i controlli. </li><li> In una cappa a flusso laminare, etichetta (o codice a barre) 17 bianchi piastre di saggio murate sterili con coperchi dai numeri 1-17, corrispondente a ciascuna piastra della serie biblioteca siRNA. </li><li> Centrifugare la piastra di controllo master e il siRNA ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2.000 xg) per garantire a tutti siRNA accumulano sul fondo del pozzo. </li><li> Utilizzare un dosatore automatico di robot &quot;stamp&quot; 10 ml di ogni controllo dalla piastra di controllo master sulle piastre di saggio 17, utilizzando la stessa pila punta 96 pozzetti per ciascuna piastra. </li><li> Utilizzando un fresco 96 pozzetti pila punta per ciascuna delle piastre di biblioteca 17, trasferimento 10 ml di ogni ubiquitome siRNA alla sua piastra di saggio corrispondente utilizzando un dosatore automatico. </li><li> Preparare 40 ml di reagente di trasfezione per i 17 piastre di saggio utilizzando i es rapportofermati in in 1.10. Nota: questo include altri 20 ml per spiegare il &quot;volume morto&quot; nel dispenser cella. Il &quot;volume morto&quot; si riferisce al volume di liquido continuamente presente all&#39;interno della rete tubo nel dispenser cella. </li><li> Utilizzare il distributore automatico cella per trasferire 10 ml di reagente di trasfezione in ciascun pozzetto in piastre di saggio 17. Brevemente agitare le piastre di saggio su un agitatore (1 min a 500 rpm) per consentire un&#39;accurata miscelazione di siRNA e reagente di trasfezione, poi lasciare ancora a temperatura ambiente per 20-60 minuti per consentire siRNA: reagente di trasfezione formazione del complesso. </li><li> Lavare due 75 centimetri 2 fiaschi di cellule U20S-HRE due volte con 10 ml di PBS e staccare con 2 ml di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 8 ml di DMEM 10% FBS ad ogni pallone e pipetta su e giù parecchie volte per creare una sospensione cellulare omogenea. Unire le celle di entrambe le boccette e trasferire a una sterile tubo di plastica da 50 ml. </li><li> Calcolare la concentrazione di cellule pipettando20 celle microlitri in duplicato in una camera di conteggio delle cellule e calcolare la concentrazione media di cella da due letture di un contatore automatico cella come descritto al punto 1.3. </li><li> Preparare 155 ml di sospensione cellulare diluendo con DMEM 10% FBS ad una concentrazione di 75.000 cellule per ml in un contenitore di plastica sterile. Nota: questo volume è sufficiente per 17 piastre e comprende ulteriori 25 ml di volume morto nel dispenser cella. </li><li> Aggiungere un agitatore magnetico sterile alla sospensione cellulare e posto su un agitatore allestito all&#39;interno della cappa a flusso laminare per limitare aggregazione delle cellule. Equilibrare il dispenser cellulare automatizzata con la sospensione cellulare e impostarlo per erogare 80 ml di cellule per pozzetto (6.000 celle). </li><li> Posizionare ciascuna delle 17 piastre, a sua volta, al dispenser cella automatizzata e dispensare cellule. Registrare il tempo e le piastre dello stack in gruppi di 5 quindi inserire pile in un umido 37 ° C incubatore al 5% di CO 2 per 24 ore. Nota: la concentrazione finale dipiscina siRNA sarà 20 nM in 100 microlitri di volume totale. Nota: Le seguenti operazioni 2,14-2,15 devono essere effettuate nel Day 2. </li><li> Avviare la seconda replica il giorno 2, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13). </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 1 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. Nota: Le seguenti operazioni 2,16-2,20 dovrebbe essere effettuata il giorno 3. </li><li> Avviare la terza replica, seguendo la procedura descritta nel Day 1 per la replica 1 (2,2-2,13). </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 2 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. </li><li> Due ore prima replicano 1 piastre devono essere rimossi dalla workstation ipossia, preparare 200 ml di tampone di lisi 2x luciferasi / dosaggio come descritto al punto 1.6. Nota: questo volume inle aderiscono ulteriori 20 ml di garantire serbatoio tampone rimane ben coperto. </li><li> Rimuovere replicare 1 piastre di saggio dalla stazione di lavoro di ipossia dopo l&#39;esposizione 24 ore ipossia e con un dosatore automatico, aggiungere 100 ml di tampone 2x luciferasi lisi / dosaggio per ogni piatto dosaggio e coprire con pellicola trasparente. </li><li> Agitare le piastre su un agitatore cella per 10 min a 500 rpm per lisare le cellule accuratamente. Trasferire ogni piatto, a sua volta a un lettore di piastre luminometro e registrare luminescenza come descritto al punto 1.8. Nota: Le seguenti operazioni 2,21-2,22 devono essere effettuate il giorno 4. </li><li> Dopo 24 ore di trasfezione, piastre di trasferimento di replica 3 in un ambiente sterile a una workstation ipossia fissati al 1% di ossigeno e lasciare per 24 ore per indurre il reporter HRE. </li><li> Leggi la replica 2 piastre seguendo i passaggi 2,18-2,20 utilizzati per replicare 1. Nota: la seguente operazione 2.23 deve essere effettuata il giorno 5. </li><li> Leggi le ripetute 3 piastre seguendopasso 2,18-2,20 utilizzato per replicare 1. </li><li> Compilare tutte e 3 le repliche dello schermo primario e calcolare il fattore Z per ogni piastra utilizzando la formula di cui al 1.12. Nota: se ogni piastra ha un fattore Z inferiore a 0,5, considerare ripetendo questa piastra per migliorare la qualità dei dati. </li><li> Calcolare il coefficiente di variazione (CV) per l&#39;alta e la bassa controlli utilizzando la seguente formula: 100 x deviazione standard di controllo / media di controllo. Nota: CV deve essere il più basso possibile, è ragionevole aspettarsi che il 10-15% di variazione. Se la variazione è significativamente più elevata, considerare ripetendo la piastra. </li><li> Calcola cento attivazione di ogni siRNA per piastra utilizzando la seguente formula: [(media di elevato controllo - punteggio siRNA) / (media di elevato controllo - medio bassa di controllo)] x 100 Inoltre, calcolare il non-target (NT. )-fold di ogni siRNA utilizzando la formula [dati / medio di NT Esempio]. Sia per l&#39;attivazione cento e NT-piega, calcolare la media dei tre ReplicAtes e compilare i valori. </li><li> Utilizzando i dati grezzi, calcolare Classificato Coefficiente di correlazione di Spearman (SRCC) per determinare quanto strettamente le tre piastre replicati in correlazione con la formula: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> dove r = SRCC; d = differenza tra i due numeri in ciascuna coppia di ranghi e n = numero di coppie di dati. Nota: una buona correlazione tra le repliche piastra darà valori prossimi a 1 Se una replica mostra partire SRCC contro gli altri 2 piastre, approfondire e considerare ripetere quel piatto.. </li><li> Decidere quali siRNA sono di sufficiente interesse per lo screening secondario (fino al 80). Impiegare cut off definite dall&#39;utente (ad esempio, la selezione di tutti i siRNA mostrano meno del 5% o oltre il 95% per cento di attivazione, o inferiore a 0,5 NT volte o più di 1,5 NT-fold) o applicare la bioinformatica o ragionamento basato sulla conoscenza per la ricerca di cluster di colpisce rientrano la stessa via UBL. Nota:normalmente, una combinazione di questi approcci determina quale siRNA sono presi in screening secondario. </li></ol> 3. Schermo secondario Nota: una schermata di conferma secondario è effettuata sulla base di un massimo di 80 siRNA di interesse dalla schermata principale. Questo numero può essere convenientemente con ciascun replicato placcato su una singola piastra a 96 pozzetti con i comandi completi come da schermata principale (vedi 2.2). E &#39;molto utile per confermare che le autorità di regolamentazione individuati nella schermata principale riproducibile suscitano lo stesso fenotipo, e questo aiuterà ad affinare le decisioni di triage su cui risultati dovrebbero essere effettuati fino alla schermata finale terziaria / deconvoluzione. <ol><li> Grow 1 x 75 cm 2 boccetta di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS. </li><li> Prendere nota del numero di targa e la posizione dei colpi dello schermo primario, e pianificare la loro nuova posizione sullo schermo secondario ciliegia raccolto piatto principale, lasciando colonne 1 and 12 gratuito per i controlli. Preparare la piastra di controllo master come in 1.9 ma con un volume totale di ogni controllo di 50 microlitri. </li><li> Scongelare una seconda serie di diluizioni della biblioteca ubiquitome (mettere da parte per i singoli piscine siRNA-cherry picking) per un minimo di 30 min. Centrifugare la piastre brevemente (1 min a 2.000 xg), quindi aggiungere 50 ml di i siRNA schermo secondario per le loro nuove posizioni piastra sulla ciliegia scelto piastra master. </li><li> Effettuare lo schermo secondario utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutti e tre repliche nella stessa giornata in una piastra di saggio per ogni replica e (b) regolare i volumi di reagenti di conseguenza. </li></ol> 4. Terziario Deconvolution Schermo / Nota: lo screening terziaria o deconvoluzione viene eseguita su un massimo di 20 siRNA dallo schermo secondario. Questo passo è quello di esaminare l&#39;effetto di knockdown con ogni singolo siRNA dalla cacca originalel di quattro. Normalmente, almeno due duplex siRNA individuali di ogni pool dovrebbero illecito lo stesso fenotipo di avere un ragionevole grado di fiducia che il fenotipo osservato non è dovuta a siRNA effetti off-target. Per aumentare ulteriormente la fiducia in questa fase, individuali supplementari duplex siRNA rivolti al gene in questione possono essere progettati e testati per la loro capacità di suscitare il fenotipo dato. I risultati di questi esperimenti possono quindi essere utilizzati per calcolare il punteggio H, dove H = 0,6 o superiore (cioè dove almeno 3 su 5 siRNAs singoli suscitare il fenotipo) è considerato accettabile 6. <ol><li> Crescere un 75 centimetri 2 fiasco di cellule U20S-HRE al 80-90% di confluenza in DMEM con 10% FBS. </li><li> Creare una mappa piastra per lo schermo superiore pianificando la posizione dei quattro duplex siRNA individuali di ciascun colpo sul piatto maestro schermo superiore, lasciando colonne 1 e 12, gratuito per i controlli. Preparare il piatto principale di controllo come in 1.9, ma con un totalevolume di ciascuna controllo di 50 microlitri. </li><li> Scongelare le piastre deconvolution / siRNA individuale e aggiungere 50 ml di singoli siRNA (200 Nm) in ciascun pozzetto della piastra maestro schermo terziaria secondo la mappa piastra (4.2) per consentire tre x 10 replicati microlitri e un comodo eccesso di 20 microlitri . </li><li> Effettuare la schermata terziaria utilizzando lo stesso protocollo di base delineato per la schermata principale con le seguenti modifiche: (a) eseguire tutte e tre le repliche nello stesso giorno in una piastra di saggio per ogni replica e (b) adeguare i volumi di reagenti di conseguenza </li></ol> Nota: Idealmente la soglia per i singoli duplex siRNA deve essere impostato alla stessa rigorosità cut-off come per la piscina. Tuttavia, può essere accettabile per rilassare la soglia del 10-20% per i singoli siRNA, specialmente dove almeno un&#39;altra duplex rientra nella soglia impostata. È cuscinetto pena ricordare che l&#39;effetto individuale di siRNA può essere inferiore a quello dila piscina, e viceversa, in alcuni casi specifici siRNA può mostrare un forte effetto sul fenotipo cellulare in isolamento rispetto a quando esiste in piscina (anche quando la concentrazione è rappresentato).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;uso di genoma di ampiezza schermi siRNA in cellule di mammifero ha dimostrato di essere estremamente utile per identificare nuovi regolatori di vie biologiche distinte. Qui, abbiamo descritto l&#39;uso di uno schermo ubiquitome siRNA targeting per identificare regolatori della risposta cellulare HIF1a mediata da ipossia. Schermi mirati stanno diventando sempre più attraente in quanto sono generalmente più economiche, più veloce, più facile da gestire e riferire solo sui componenti della via in cui gli investig...

Modifica delle proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) rappresenta un sistema biochimico espansiva che regola diverse vie biologiche e risposte allo stress. L&#39;attacco covalente di UBLs alle loro proteine ​​bersaglio può avere vari risultati che regolano la stabilità, localizzazione, funzione o interattoma del substrato 1. I passaggi enzimatici sottostanti modifica UBL sono stati stabiliti in primo luogo per ubiquitina, e ora servono come paradigma per la modifica con la maggior parte UBLs, tra cui SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Per modifica si verifichi, il gruppo carbossilato del diglycine motivo LBM viene prima attivato da un enzima attivando E1 a formare un tiolo ad alta energia che viene trasferita al sito attivo di un enzima cisteina coniugare E2. Il E2 poi interagisce con un substrato con associazione E3 ligasi di mediare trasferimento della LBM su (di solito) un residuo di lisina bersaglio creando una catena ramificata (isopeptide) linkage 2. Cicli successivi di modifica può verificarsi per costruire catene isopeptide sul substrato, che per ubiquitina può avvenire attraverso uno dei suoi sette lisine, o attraverso la metionina N-terminale per creare catene di ubiquitina lineari. Queste modifiche formano topologie discrete con finalità diverse come la creazione di nuovi motivi di interazione e di targeting delle proteine ​​per la degradazione prima della rimozione UBL da proteasi specializzati. Nel caso di ubiquitina ci sono due enzimi E1, E2 30-40 enzimi coniugando, almeno 600 E3 ligasi e circa 100 enzimi deubiquitylating (Dubs). Mentre le vie sono meno espansiva per gli altri 10 o giù di lì UBLs, complessità generale ubiquitome offre grande diversità nel risultato biologico di una modifica particolare UBL. Tuttavia, mentre sono stati compiuti importanti progressi nella UBL biologia, i ruoli cellulari precise della maggior parte di questi componenti ubiquitome rimangono sconosciute. L&#39;uso di short intacido ribonucleico erfering (siRNA) è emersa come un potente strumento in genetica inversa a causa della capacità di siRNA per indirizzare specificamente mRNA cellulari per la distruzione, consentendo il ruolo dei singoli geni da esaminare in contesti biologici differenti 3. Schermi genoma interi sono stati utilizzati per identificare e validare nuovi regolatori di molti processi cellulari, e hanno creato una grande quantità di dati utili accessibili alla più ampia comunità scientifica. Tuttavia, mentre gli schermi intero genoma si sono dimostrati estremamente utili, schermi mirati stanno diventando sempre più popolari come sono più economici, più veloci, coinvolgere meno la gestione dei dati e la relazione solo sui membri del genoma in cui il ricercatore è più interessati. Pertanto, per capire meglio quali componenti della famiglia processi cellulari UBL sono coinvolti in, abbiamo compilato una libreria siRNA umano mira tutti noti e previsti componenti del ubiquitome. Questo include i UBLs, E1, E2 enzimi attivatori coniugandoenzimi, ligasi E3, ubiquitina-legame dominio (UBD) contenenti proteine ​​e dubs. Questa libreria può essere usata per schermo contro un&#39;ampia gamma di linee cellulari giornalista di problemi biologici distinti, permettendo così l&#39;identificazione corretto di componenti UBL nuovi disciplinano queste vie. Il protocollo che segue descrive come eseguire un rigoroso siRNA mirato ubiquitome schermo per identificare nuovi regolatori della risposta HIF1a-dipendente all&#39;ipossia. Sotto tensione normale di ossigeno, HIF1a è soggetto a idrossilazione prolyl che induce a essere riconosciuto e mirato per la degradazione da parte del Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligasi complesso 4. Ipossia inibisce idrossilazione prolyl porta alla stabilizzazione di HIF1a e il suo successivo legame ad elementi di risposta ipossia (HRES) per guidare l&#39;espressione genica. Qui, descriviamo uno schermo mediante cellule di osteosarcoma U20S che esprimono stabilmente lucciola luciferasi sotto il controllo di tre copie tandem del Hypoxia Response Element (cellule U20S-HRE) 5. Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi via biologica se un robusto lettura di attività di giornalista è realizzabile e può essere accoppiato con appropriati controlli positivi e negativi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

Modificazione post-traslazionale di proteine ​​con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) sta emergendo come una rete di segnalazione cellulare dinamica che regola diverse vie biologiche, tra cui la risposta all&#39;ipossia, proteostasis, la risposta al danno al DNA e la trascrizione. Per capire meglio come UBLs regolano i percorsi relativi alla malattia umana, abbiamo compilato una siRNA umano &quot;ubiquitome&quot; biblioteca composta da 1.186 siRNA piscine su due piani destinati a tutti noti e previsti componenti dei percorsi del sistema UBL. Questa libreria può essere proiettato contro una serie di linee cellulari esprimenti reporter di diverse vie biologiche per determinare i componenti UBL agiscono come regolatori positivi o negativi della via in questione. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza questa libreria per identificare ubiquitome-regolatori della risposta cellulare HIF1a-mediata all&#39;ipossia utilizzando un reporter luciferasi basato trascrizione. Una fase di sviluppo iniziale di analisiviene eseguita per stabilire parametri di schermatura della linea cellulare prima di eseguire lo schermo in tre fasi: di screening / deconvoluzione primaria, secondaria e terziaria. L&#39;uso di mirata su intere librerie genoma siRNA sta diventando sempre più popolare in quanto offre il vantaggio di notifica solo per i membri del percorso con cui i ricercatori sono più interessati. Nonostante i limiti intrinseci dello screening siRNA, in particolare falsi positivi causati da siRNA effetti off-target, l&#39;identificazione di veri e propri nuovi regolatori dei percorsi in questione superano queste carenze, che possono essere superati eseguendo una serie di esperimenti di controllo con attenzione intraprese.

Prima della proiezione, viene stabilita la ipossia-responsività delle cellule U20S-HRE. Cellule U20S-HRE esprimono un costrutto giornalista costituito da luciferasi di lucciola fuso valle di tre copie tandem dell&#39;elemento risposta all&#39;ipossia, che è vincolato da dell&#39;eterodimero HIF1A/HIF1B in caso di esposizione all&#39;ipossia (Figura 1A). Le cellule sono posti in una workstation ipossia per un intervallo di tempo per stabilire l&#39;esposizione ipossia produce la risposta più efficace ...

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siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato &quot;ubiquitome&quot; schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all&#39;ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  University of Dundee.  Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato "ubiquitome" schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile. 

Video: siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Ricerca

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell&#39;espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging locale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Segnali in cellule di mammifero coltivate

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...