Questo protocollo descrive l'imaging in vivo stabilizzato e ripetitivo a livello cellulare del pancreas con una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile eseguire immagini tridimensionali immobili con risoluzione fino al livello cellulare per tre settimane nel pancreas di un topo vivo. Inizia preparando la piattaforma chirurgica e disinfettando le superfici con il 70% di etanolo.
Dopo l'anestesia, utilizzare una sonda rettale con una piastra riscaldante controllata da omeotermico per monitorare la temperatura corporea. Rimuovere i peli dal fianco sinistro del mouse e applicare alcol e iodio in alternativa, ruotando dal sito di incisione alla superficie esterna, non tornando mai al sito di incisione e terminando con iodio. Quindi, fai un'incisione di 1,5 centimetri sul fianco sinistro del topo, sezionando la pelle e il muscolo.
Utilizzare una sutura 4-0 nera o di nylon per eseguire una sutura della corda della borsa nel margine dell'incisione. Tirare accuratamente la milza con una pinza ad anello e identificare il pancreas. Posizionando la finestra sul fianco del mouse, passare la milza e il pancreas attraverso lo spazio aperto della finestra.
Quindi, posizionare delicatamente il pancreas sulla piastra della finestra di imaging mentre si posiziona la milza sullo spazio aperto della finestra. Iniettare PANC-1 nuclite rosso direttamente nel pancreas. Utilizzare un ago per catetere calibro 31 per applicare gocce di colla cianoacrilato di n-butile al margine della finestra di imaging, assicurando che venga applicata una quantità minima di colla.
Applicare delicatamente un vetro di copertura rotondo da 12 millimetri sul margine della finestra di imaging. Quindi, tenere premuto il circuito di sutura per adattarlo alla scanalatura laterale della finestra e legarlo tre volte. Infine, per evitare l'interruzione di questi punti stretti quando i topi sono svegli, tagliare il sito massimo prossimale della cravatta.
Inizia accendendo il microscopio intravitale, compresa la potenza del laser. Per inserire un catetere vascolare, applicare una pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito. Se necessario riscaldare la coda con una lampada.
Disinfettare la vena della coda con uno spray al 70% di etanolo, quindi inserire un catetere calibro 30 nella vena laterale della coda e visualizzare il rigurgito di sangue nel tubo PE-10. Applicare del nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo. Iniettare destrano FITC e destrano TMR o altre sonde fluorescenti a seconda dei casi, in base alla combinazione di sonde fluorescenti.
Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con un sistema di termoforo omeotermico. Quindi, inserire la finestra di imaging pancreatico preparata durante la configurazione della microscopia intravitale nel supporto della finestra. Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica alla fase di imaging.
Per eseguire l'imaging intravitale, iniziare con l'imaging del pancreas a basso ingrandimento, ad esempio quattro volte, per scansionare l'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico. Una volta determinata la regione di interesse, passare a un obiettivo a ingrandimento più elevato, come 20 volte o 40 volte, per eseguire l'imaging a livello cellulare con risoluzione laterale e assiale di circa 0,5 micrometri e 3 micrometri rispettivamente. Esegui l'imaging Z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare come la migrazione cellulare.
La microscopia intravitale combinata con la finestra di imaging intravitale pancreatico fornisce stabilità tissutale a lungo termine che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per tracciare le singole isole per un massimo di tre settimane. La finestra impiantata in un topo C57 nero 6 N con anticorpo anti-CD31 iniettato per via endovenosa, coniugato con un fluoroforo Alexa 647, ha facilitato l'imaging ad ampia area e l'ingrandimento 3D del pancreas. Le cellule acinari sono state identificate nelle immagini medie del tessuto pancreatico nella vascolarizzazione adiacente, visualizzate utilizzando rispettivamente l'autofluorescenza e l'anticorpo anti-CD31.
Utilizzando il metodo di imaging a mosaico, che combina una vista ad ampio campo con l'imaging ad alta risoluzione, circa 40-50 isole con la vascolarizzazione adiacente sono state visualizzate in un mouse MIP-GFP. Uno studio precedente ha dimostrato che le isole possono essere monitorate per un massimo di tre settimane utilizzando questo metodo di imaging stabile. Per visualizzare le cellule tumorali, i globuli rossi nuclite PANC-1 sono stati impiantati direttamente nel pancreas del topo durante l'intervento chirurgico e i vasi vicini sono stati colorati con anti-CD31 coniugato con Alexa 647.
Utilizzando questo protocollo, sono state generate immagini ad ampio campo del cancro del pancreas. Ciò ha contribuito a delineare il margine del tumore, oltre a ottenere immagini 3D ad alta risoluzione a livello di singola cellula. Il passo più critico in questo metodo è l'abile impianto della finestra di imaging pancreatico nel topo.
Utilizzando altre combinazioni di cellule di topo fluorescenti e sonde anticorpali, è stato possibile identificare l'interazione dinamica delle cellule vicine con isole o cellule cancel. Questo metodo può essere ampiamente applicato da coloro che esplorano il cambiamento dell'isolotto in varie condizioni fisiopatologiche e micro-ambienti del cancro del pancreas in situ.
