L'esposizione allo stress può causare aggregazione proteica e provocare alterazioni significative nel comportamento fenotipico dei batteri. La procedura descritta in questo video consente l'estrazione e la visualizzazione di aggregati proteici dopo il trattamento dello stress. A differenza di altre procedure pubblicate, questo protocollo richiede un numero di cellule inferiore e si astiene da complicati processi di interruzione fisica, nonché fasi di lavaggio e incubazione che richiedono tempo.
Questo protocollo può essere utilizzato per studiare l'aggregazione proteica in un'ampia varietà di batteri gram-negativi e gram-positivi. È inoltre possibile analizzare l'effetto delle delezioni geniche o confrontare l'efficacia dei composti proteotossici. Inizia inoculando una singola colonia di E.coli ceppo MG1655 e uropatogeno E.coli ceppo CFT073, ciascuno in cinque millilitri di brodo di lipogenesi, o LB, medio.
Incubare le due colture di brodo a 37 gradi Celsius e 300 giri / min per 14-16 ore. Diluire ogni ceppo a una densità ottica a 600 nanometri, o OD600, di 0,1 in un pallone da 500 millilitri contenente 70 millilitri di terreno MOPS-g. Incubare i palloni a 37 gradi e 300 giri / min fino a raggiungere la fase di metà log.
Dopo l'incubazione, trasferire 20 millilitri di ciascuna coltura in tre palloni da 125 millilitri preriscaldati e incubarli a 37 gradi Celsius e 300 giri / min per due minuti. Preparare una soluzione di composto antimicrobico da due milligrammi per millilitro in mezzo MOPS-g. Aggiungere questa soluzione a ciascuna coltura per raggiungere le concentrazioni desiderate e aggiungere il volume richiesto di terreno MOPS-g per il controllo non trattato.
Determinare l'OD600 di ogni coltura dopo 45 minuti di trattamento dello stress. Per ogni campione, aliquota quattro millilitri di coltura con un OD600 di uno in tubi centrifughi da 15 millilitri. Riconsoscidare i pellet cellulari in 50 microlitri di tampone di lisi ghiacciato-freddo.
Incubare i campioni per 30 minuti sul ghiaccio. Aggiungere 360 microlitri di tampone A ghiacciato ai campioni e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Trasferire i campioni in tubi microcentrifuga da due millilitri con circa 200 microlitri di perle di vetro da 0,5 millimetri.
Incubare i tubi per 30 minuti a otto gradi Celsius in un Bimbyer con agitazione a 1400 giri / min. Incubare i tubi sul ghiaccio per cinque minuti senza agitare per sistemare le perle di vetro. Quindi trasferire 200 microlitri del llisi cellulare in tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri.
Centrifugare il lussato cellulare per 20 minuti a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante, che verrà utilizzato come campione proteico solubile in seguito. Utilizzare una pipetta per ricaspendare il pellet in 200 microlitri di tampone ghiacciato A.Centrifugare i tubi a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi rimuovere con attenzione il surnatante del tutto. Utilizzare una pipetta per risuscidere accuratamente il pellet in 200 microlitri di tampone ghiacciato B.Centrifugare nuovamente i tubi e rimuovere con cura il surnatante. Quindi ripetere il lavaggio con tampone A.Resuspend il pellet in 100 microlitri di 1x riducendo il tampone del campione SDS e farlo bollire per cinque minuti in un Bimbyer a 95 gradi Celsius.
Mescolare un volume di 100% TCA con quattro volumi del campione proteico solubile raccolto in precedenza e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius per la precipitazione delle proteine. Centrifugare il campione a 21.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per ottenere il precipitato e rimuovere il surnatante. Utilizzare 200 microlitri di acetone ghiacciato per lavare il pellet, per rimuovere i detriti cellulari.
Centrifugare nuovamente il campione per ottenere il precipitato e rimuovere il surnatante. Per rimuovere l'acetone rimanente dal pellet, tenere i tubi microcentrifuga nel Bimbyer a 37 gradi Celsius con i coperchi aperti. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone SDS riducente 1x per sciogliere completamente il pellet e far bollire il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti.
Caricare immediatamente il campione su un gel di poliacrilammide SDS per la separazione o conservare il campione a meno 20 gradi Celsius per procedere in un secondo momento. Preparare due gel di separazione come descritto nel manoscritto di testo. Versare il gel tra le lastre di vetro usando una pipetta da un millilitro, assicurandosi che i due centimetri superiori siano privi della miscela.
Aggiungere il 70% di etanolo sopra il gel separatore, creando un'interfaccia uniforme tra i due strati. Una volta che i gel di separazione hanno polimerizzato, preparare i gel impilabili utilizzando le istruzioni nel manoscritto di testo. Quindi rimuovere l'etanolo dai gel di separazione e aggiungere la soluzione di gel impilante.
Inserire con attenzione un pettine con il numero desiderato di tasche senza introdurre bolle d'aria e lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti. Caricare quattro microlitri di ciascun campione, così come la scala proteica, in pozzi separati. Quindi eseguire il gel in un tampone di corsa tris-glicina a 144 volt per 45 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzare la soluzione Fairbanks preriscaldata A per macchiare i gel su un bilanciere per 30 minuti e la soluzione Fairbanks preriscaldata D per decolorare i gel su un bilanciere fino a raggiungere lo sfondo desiderato. È stato osservato un aumento della quantità di aggregato proteico formato quando le cellule sono state trattate con 175 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro di antimicrobico, rispetto alle cellule non trattate. L'aumento della frazione proteica insolubile è stato più pronunciato nel ceppo MG1655 più sensibile.
Una diminuzione è stata osservata nella quantità di proteine solubili quando le cellule sono state trattate con 175 microgrammi per millilitro e 200 microgrammi per millilitro di antimicrobico, rispetto alle cellule non trattate. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la normalizzazione alla densità ottica a 600 nanometri è importante per il confronto dell'entità dell'aggregazione proteica nei campioni.
