La purificazione delle proteine ricombinanti dai batteri è un metodo ben consolidato. Tuttavia, possono verificarsi diversi problemi durante l'utilizzo di queste tecniche. Avere metodi per estrarre proteine dai tessuti è sicuramente attraente.
Il vantaggio principale di questo metodo è che si può estrarre la proteina nella sua forma fisiologica, compresi tutti gli effetti reciproci che possono influire sul suo ripiegamento e sull'attività catalitica. Questo approccio può essere adattato ad altre proteine di interesse e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e inibitori farmacologici.
Per iniziare, preparare il tampone di lisi proteica mescolando 250 millilitri di PBS con 50 millimolari fluoruro di sodio, un fluoruro di fenilmetilsulfonil millimolare, due microgrammi per millilitro aprotinina e un ortovanadato attivato millimolare. Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 micrometri. Preparare i tubi con due millilitri di tampone di lisi per grammo di tessuto e metterli sul ghiaccio.
Per preparare il campione di tessuto, sezionare il tessuto di circa 100 milligrammi ciascuno su una lastra di vetro pre-pulita posta sul ghiaccio in una scatola di polistirene espanso. Trasferire i pezzi di tessuto nei tubi preparati per la successiva lisi. Per preparare una soluzione satura di solfato di ammonio, riscaldare 500 millilitri di acqua doppia distillata a 70 gradi Celsius.
Mentre si mescola, aggiungere gradualmente solfato di ammonio in polvere fino a quando non si scioglie più solfato di ammonio. Raffreddare questa soluzione satura a temperatura ambiente e conservarla a quattro gradi Celsius durante la notte. Per omogeneizzare i tessuti renali suini, sonicare la sospensione preferibilmente con una sonda ad ultrasuoni mantenendo il campione sul ghiaccio.
Nel caso di tessuti epatici di topo, utilizzare un omogeneizzatore elettrico e lavarlo regolarmente in PBS per evitare l'intasamento mantenendo i campioni sul ghiaccio. Prelevare 20 microlitri dai campioni e verificare al microscopio se le cellule del tessuto omogeneizzato sono correttamente distrutte. Altrimenti, ripeti l'omogeneizzazione.
Centrifugare i tubi a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e metterlo sul ghiaccio. Successivamente filtrare il surnatante utilizzando unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri.
Aliquotare il surnatante in lotti da 10 millilitri e congelarli a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per una conservazione più lunga. Preparare un campione di 50 microlitri per l'analisi SDS-PAGE o Western blot aggiungendo 10 microlitri di cinque volte il buffer del campione SDS a 40 microlitri del surnatante e quindi bollendo a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Preparare un gel discontinuo al 12,5% di poliacrilammide SDS-PAGE secondo le istruzioni del produttore.
Per eseguire l'analisi SDS-PAGE, caricare successivamente i pozzetti del gel con una scala marcatore proteica, cinque nanogrammi di proteina ricombinante FAHD1 umana come controllo positivo, 20 microlitri del campione da analizzare e i restanti pozzetti con 20 microlitri di tampone campione SDS-PAGE preparato. Eseguire i gel SDS-PAGE a 125 volt utilizzando il buffer di funzionamento SDS. Dopo aver completato SDS-PAGE, eseguire un'analisi Western blot, sondare le membrane utilizzando l'anticorpo disponibile sollevato contro FAHD1.
Dopo aver preparato aliquote surnanti come descritto in precedenza, procedere dopo lo scongelamento o processo direttamente dopo l'estrazione delle proteine senza congelare il campione. Filtrare il campione utilizzando un'unità filtrante da 0,22 micrometri per escludere possibili precipitati dopo lo scongelamento. Preparare sei tubi da 1,5 millilitri su ghiaccio, quindi trasferire 250 microlitri di campione in ciascun tubo.
Preparare una serie di diluizione di solfato di ammonio nei tubi preparati e portare il volume finale a 1.000 microlitro con tampone di lisi proteica. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte su un rotatore valvolare. Utilizzando una centrifuga da tavolo, centrifugare a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire con cura tutti i supernatanti in tubi separati.
Asciugare all'aria i pellet risultanti e risospestarne ciascuno in 1.000 microlitro di acqua doppia distillata. Per ogni coppia di pellet risospeso e surnatante del passaggio precedente, mescolare 40 microlitri con 10 microlitri di cinque volte il tampone del campione SDS e far bollire a 95 gradi Celsius con coperchi aperti fino a quando la maggior parte del liquido non si è vaporizzata. Quindi risospesare il pellet in una miscela di 50% di dimetilsolfossido in acqua doppia distillata.
Eseguire SDS-PAGE caricando i campioni derivati dal pellet risospeso e dal surnatante in coppia, seguiti da un'analisi Western blot. Tuttavia, eseguire i gel a 80 volt per tre ore. Impostare il sistema FPLC con la colonna di scambio anionico o cationico.
Lavare la colonna con cinque volumi di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione, seguita da cinque volumi di colonna di acqua a doppia distillazione. Applicare il campione sulla colonna mediante iniezione o utilizzando una pompa campione e raccogliere il flusso attraverso. Lavare la colonna con un volume di colonna del buffer a basso contenuto di sale.
Impostare un'eluizione a gradiente lineare dal tampone salino basso al 100% al tampone salino alto 100% all'interno di tre volumi di colonna. Raccogliere continuamente frazioni di un millilitro. Al termine del gradiente, continuare a funzionare con un tampone salino elevato fino a quando non vengono rilevati più picchi associati alle proteine nel cromatogramma nell'intervallo di un volume di colonna.
Applicare un millilitro di 25% SDS disciolto in idrossido di sodio molare 0,5 e acqua doppia distillata per pulire la colonna. Lavare consecutivamente la colonna con tre volumi a colonna di acqua doppia distillata e tre volumi a colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Raccogliere i campioni SDS-PAGE di tutte le frazioni di picco e il flusso attraverso.
Snap congelare le frazioni raccolte in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Dopo averli sondati tramite Western blot, scongelare e raggruppare le frazioni contenenti le proteine di interesse e scartare le altre. Per eseguire la fase di purificazione, ridurre il volume della soluzione proteica fino a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione.
Filtrare sequenzialmente la soluzione con unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri per rimuovere qualsiasi microprecipitazione. Equilibrare la colonna di cromatografia di esclusione dimensionale con un volume di colonna di buffer in esecuzione contenente un ditiotreitolo millimolare. Caricare il campione sulla colonna ed eseguire l'unità di cromatografia fino a quando tutte le proteine sono eluite come descritto in precedenza.
Preparare 50 campioni di microlitro per l'analisi SDS-PAGE e Western blot descritta in precedenza. Lavare consecutivamente la colonna con un volume di colonna di acqua doppia distillata e un volume di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Dopo aver eseguito l'analisi Western blot, raggruppare tutte le frazioni contenenti FAHD1.
Ridurre il volume della soluzione proteica a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione. Lo screening Western blot mostra la presenza di FAHD1 suino nel surnatante con una banda a 25 kilodalton mentre il controllo positivo taggato corre a 34 kilodalton. Il fahd1 suino dal lisato è stato purificato mediante cromatografia a scambio anionico e le proteine leganti sono state rimosse mediante eluizione.
Le frazioni contenenti FAHD1 suino sono state identificate mediante analisi Western blot, raggruppate e concentrate. I campioni di proteine sono stati purificati dalla SEC e identificati dall'analisi Western blot. La resa della proteina FAHD1 suina era di circa un milligrammo con un livello di purezza dell'80%.
L'analisi Western blot ha rilevato la proteina FAHD1 del topo nel flusso attraverso insieme ad altre proteine. Il flow-through è stato applicato per la cromatografia di esclusione dimensionale. Le frazioni contenenti FAHD1 sono state raggruppate, concentrate e applicate all'analisi SDS-PAGE.
Tuttavia, la resa delle proteine non era molto alta. L'attività enzimatica specifica del suino FAHD1 aumenta con il livello di purezza aumentando la quantità relativa di FAHD1 per proteina totale. Concentrazioni più elevate di solfato di ammonio causano l'effetto sorriso, che può essere risolto a una tensione inferiore.
Ulteriori proteine sono state trovate nel lisato e nel surnatante alla concentrazione del 15%. Tuttavia, a concentrazioni più elevate, i campioni possono precipitare e non possono essere rilevati. Il protocollo qui presentato richiede che la proteina sia risolvibile.
Le condizioni ottimali per la precipitazione e la regolazione del pH o delle dimensioni per la cromatografia devono essere testate e definite. Lo studio della funzione enzimatica, lo studio della struttura proteica e lo sviluppo di anticorpi sono notevolmente supportati quando si hanno proteine estratte dai tessuti piuttosto che estratte dai batteri.
