La tecnica ELISA è molto utile per rilevare il parassita della malaria nel vettore della zanzara con elevata sensibilità e specificità, e in grado di elaborare molti campioni allo stesso tempo. Questa tecnica consente ai ricercatori di conservare i campioni di zanzara fino a quando non sono pronti per l'elaborazione dei campioni e può essere eseguita per differenziare le specie di Plasmodium utilizzando anticorpi monoclonali specie-specifici. Preparare il campione separando la testa e il torace delle zanzare dall'addome e metterli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri pre-etichettata.
Aggiungere 50 microlitri di tampone di macinazione a ciascuna provetta e omogeneizzare il campione con un pestello. Sciacquare il pestello con 250 microlitri di tampone di macinazione e aggiungere la soluzione al tubo per portare il volume finale fino a 300 microlitri. Prepara una piastra ELISA per la proteina circumsporozoite e compila il foglio di lavoro ELISA per sporozoiti.
Preparare la soluzione di anticorpi in PBS e aggiungere cinque millilitri di soluzione per piastra. Pipettare 50 microlitri della soluzione anticorpale in ciascun pozzetto della piastra ELISA. Mettere un coperchio sulla piastra e incubare per 30 minuti o per una notte a temperatura ambiente.
Aspirare la soluzione nel pozzetto e picchiettare cinque volte la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido. Aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante nelle piastre a pozzetti e coprire con un coperchio. Incubare per un'ora a temperatura ambiente e aspirare il contenuto del pozzetto.
Picchiettare nuovamente la piastra su un tovagliolo di carta per rimuovere il liquido. Aggiungere 50 microlitri di controllo positivo ai pozzetti H uno e H due. Quindi aggiungere 50 microlitri di tampone bloccante nei pozzetti nelle colonne uno e due delle file da C a G. Aggiungere 50 microlitri del controllo positivo nei pozzetti G uno e G due.
Diluire in serie il controllo positivo partendo da G uno e G due, seguito da F uno e F due fino a C uno e C due. Aggiungere 50 microlitri di controllo negativo ai pozzetti A uno, A due, B uno e B due. Estrarre 50 microlitri della soluzione di omogeneizzato e aggiungerla a un pozzetto sconosciuto.
Coprire la piastra e incubarla a temperatura ambiente per due ore. Preparare la soluzione del substrato mescolando il substrato A e B in un rapporto di uno a uno. Determinare il volume richiesto in base all'aggiunta di cinque millilitri di soluzione di anticorpi coniugati di lavoro a ciascuna piastra.
Valutare l'attività della perossidasi aggiungendo cinque microlitri della soluzione di anticorpo marcata con perossidasi a 100 microlitri della soluzione di substrato in una provetta da 1,5 millilitri. Aspirare il pozzetto e rimuovere il liquido mettendo la piastra capovolta su un tovagliolo di carta. Lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di PBS Tween.
Aspirare il contenuto del pozzetto e picchiettare la piastra cinque volte. Aggiungere 50 microlitri di soluzione anticorpale marcata con perossidasi a ciascun pozzetto. Quindi incubare al buio per un'ora a temperatura ambiente.
Aspirare il pozzetto e picchiettare cinque volte il piatto su un tovagliolo di carta. Lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBS Tween tre volte, aspirare il contenuto e picchiettare la piastra cinque volte. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato a ciascun pozzetto.
Coprire la piastra e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, leggere l'assorbanza a 405-414 nanometri utilizzando un lettore di piastre ELISA. Etichettare i campioni con assorbanza con un valore superiore al cutoff come positivo e determinare la concentrazione di CSP nel campione utilizzando lo standard.
Tracciare i valori di assorbanza rispetto alla concentrazione della soluzione per generare una curva standard. Determinare l'adattamento migliore utilizzando il metodo della regressione lineare. Risolvi l'equazione di ciascun valore di assorbanza per un campione positivo per determinare la concentrazione di CSP.
Dopo 30 minuti di esecuzione dell'ELISA con ABTS, l'infezione da sporozoite potrebbe essere rilevata dalla comparsa di un debole colore verde nel pozzo. Il controllo positivo non ha mostrato alcun cambiamento di colore nel pozzo. Sono stati determinati i valori di assorbanza per i pozzetti negativi e positivi.
Il pozzo positivo ha mostrato un valore di assorbanza superiore alla soglia di cutoff, mentre i controlli negativi hanno mostrato valori significativamente più bassi. Inoltre, sono stati ottenuti anche i valori di assorbanza degli altri 80 pozzi sconosciuti. La linea continua rappresenta l'assorbanza media dei pozzetti di controllo negativi e la linea tratteggiata rappresenta la soglia di positività.
Utilizzando la curva standard, la concentrazione di CSP nel pozzo A sette è stata determinata in 0,35 picogrammi per microlitro Questa fase dell'elaborazione ELISA deve essere eseguita rapidamente per prevenire il vettore aspecifico. Inoltre, tutti i campioni e la soluzione devono essere conservati in frigorifero per prevenire la crescita microbica. Si raccomanda ai ricercatori di confermare i rilevamenti positivi con altri metodi come la PCR.
Ciò migliorerà significativamente la fiducia, soprattutto quando l'unica lettura è valutata al di sopra della soglia. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori di condurre indagini su larga scala di possibili infezioni nelle zanzare, il che è importante per identificare il vettore principale.
