Il protocollo dimostra un metodo affidabile e riproducibile per isolare e coltivare cellule endoteliali di elevata purezza da topi che potrebbero avere molteplici applicazioni. Questa tecnica è un metodo più semplice che preserva la resa e la purezza delle cellule endoteliali. A dimostrare la procedura sarà Nina Nguyen, una ricercatrice associata del mio laboratorio.
Per iniziare, vortice le perle magnetiche per alcuni secondi. Pipettare 50 microlitri delle perle in due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per CD31 e CD102. Aggiungere un millilitro di tampone per il lavaggio delle perline e mescolare bene.
Posizionare i tubi su un separatore magnetico e rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur in vetro. Risospendere le perle in 50 microlitri di tampone per il lavaggio delle perline. Quindi aggiungere cinque microlitri o 2,5 microgrammi di anticorpi CD31 o CD102 ogni 50 microlitri di perline.
Incubare la sospensione del cordone con una leggera rotazione su un rotatore terminale durante la notte a quattro gradi Celsius o per tre ore a temperatura ambiente. Lavare le immunosfere quattro volte e quindi risospendere le immunosfere in 50 microlitri di tampone di lavaggio delle perle. Il giorno dell'isolamento, aggiungere 25 millilitri di HBSS a 25 milligrammi di collagenasi di tipo uno e incubarlo con una leggera rotazione.
Quindi filtrare utilizzando un filtro da 22 micrometri. Dopo aver eutanasia un cucciolo di topo di cinque-sette giorni, spruzzare la carcassa con etanolo al 70%. Quindi, tagliare il diaframma verso l'alto lungo tutte le pareti laterali del torace per esporre la cavità toracica.
Iniettare cinque millilitri di DMEM freddo nel ventricolo destro del cuore fino a quando i polmoni diventano bianchi. Quindi tagliare i lobi distali ai bronchi corrispondenti uno per uno per rimuovere i polmoni. Tirare i lobi polmonari in un tubo conico da 50 millilitri preriempito con 20 millilitri di mezzo basale ghiacciato.
Agitare delicatamente il tubo a mano per 10-15 secondi per lavare eventuali globuli rossi in eccesso. Rimuovere i polmoni dal supporto con un colino cellulare e tritare con forbici sterilizzate. Trasferire il tessuto tritato nel tubo conico da 50 millilitri con 25 millilitri di soluzione di collagenasi preriscaldata.
Agitare delicatamente su un miscelatore rotante. Attaccare una siringa da 20 millilitri a una cannula smussata da 15 gauge e triturare vigorosamente la sospensione senza schiumare da 10 a 15 volte in una sospensione cellulare. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri.
Quindi sciacquare il tubo conico utilizzato per la digestione e il filtro cellulare con 15 millilitri di mezzo basale. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in due millilitri di mezzo completo.
Aggiungere otto millilitri di mezzo completo e incubarlo. Il giorno seguente, lavare i palloni due volte con 10 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio e aggiungere 10 millilitri di terreno completo. Una volta che le cellule sono confluenti dal 90 al 95%, sono pronte per l'isolamento immunologico primario.
Lavare le cellule endoteliali aderenti due volte con 10 millilitri di HBSS senza calcio e magnesio. Aggiungere due millilitri di soluzione di distacco cellulare priva di tripsina e incubarla per garantire il sollevamento di tutte le cellule dal pallone. Aggiungere otto millilitri di mezzo basale.
Quindi, ruotare le cellule a 400 volte G per quattro minuti a temperatura ambiente e risospenderle in due millilitri del mezzo basale. Perle rivestite Vortex anti-CD31 per alcuni secondi per risospendere le perle. Aggiungere 30 microlitri di perline per ogni due millilitri di sospensione cellulare e fissare il coperchio.
Incubare il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente su un rotatore end over end. Quindi posizionare i tubi su un separatore magnetico per due minuti. Aspirare il surnatante e rimuovere il tubo dal magnete.
Risospendere il pellet di cellula a perline aggiungendo tre millilitri di mezzo basale al tubo e pipettando su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul separatore magnetico per due minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante usando una pipetta Pasteur di vetro.
Dopo il lavaggio finale, quando il surnatante diventa chiaro, risospendere il pellet di cellule a perline in tre millilitri di terreno di crescita completo e trasferirlo in un matraccio T75. Aggiungere sette millilitri del mezzo di crescita completo e incubarlo. Il giorno successivo, rilavare le cellule con HBSS senza calcio e magnesio.
Quindi aggiungere 10 millilitri di mezzo completo. Una volta che le cellule sono confluenti dal 90 al 95%, sono pronte per l'isolamento secondario delle immunosfere. La prima selezione di immunobead identifica le cellule CD31 positive, che crescono in una formazione di ciottoli.
Una seconda selezione di immunobead con perline rivestite anti-CD102 aumenta la purezza delle cellule endoteliali e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza viene utilizzata per confermare che la popolazione cellulare è CD31 positiva e CD102 positiva. Per studiare le vie infiammatorie endoteliali e la funzione della barriera endoteliale, il trattamento con Cytomix murino è stato utilizzato per indurre una significativa produzione di IL-6 da parte delle cellule endoteliali con un valore P inferiore a 0,01. Inoltre, la resistenza transendoteliale è diminuita mostrando una maggiore permeabilità endoteliale.
Le cellule endoteliali isolate possono essere utilizzate nelle stimolazioni delle cellule endoteliali o nei saggi della funzione di barriera per scoprire bersagli terapeutici a base endoteliale per i disturbi della disfunzione endoteliale.
