Questo protocollo utilizza un nuovo approccio di campionamento del corion dall'ovi farfalla tratteggiato per l'analisi genetica. Può essere particolarmente utile quando altre tecniche di campionamento dei tessuti sono poco pratiche, non disponibili o non consentite. Questo protocollo ha un costo complessivo relativamente basso utilizzando forniture facili da acquisire e mira al materiale organico residuo che elimina la necessità di catturare o manipolare temporaneamente e potenzialmente danneggiare gli organismi viventi per acquisire campioni genetici.
Il protocollo generale è semplice e facile da imparare, ma richiede destrezza e rigorosa attenzione ai dettagli, in particolare per individuare, identificare e rimuovere con successo campioni target molto piccoli per evitare la contaminazione incrociata tra gli eventi di raccolta dei campioni. Inizia esaminando attentamente e raccogliendo l'elenco completo delle forniture relative alla raccolta necessarie. Se la raccolta dei campioni avviene in più sedi o da più individui o squadre, raccogliere e organizzare tutte le forniture necessarie in unità dispiegabili separate.
Trasportare forniture agli scienziati della comunità o ad altro personale responsabile della raccolta sul campo. Se il personale non è locale, imballare accuratamente le forniture in una scatola di cartone separata con un'etichetta di spedizione completa e spedirle. Al ricevimento delle forniture di raccolta, compresa la scatola di attrezzatura da raccolta, esaminare attentamente l'elenco di fornitura laminato e condurre un inventario completo.
Avvisare il responsabile del progetto se mancano forniture. Preriempire provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 180 microlitri di tampone di lisi. Applicare un'etichetta identificativa univoca prestampata a ciascuna provetta per microcentrifuga e posizionare tutti i tubi nella scatola di stoccaggio del tubo per microcentrifuga a 64 pozzetti.
Fissare saldamente il coperchio dopo il caricamento. Assicurarsi che tutte le apparecchiature digitali siano completamente cariche e che tutte le batterie di ricambio siano imballate. Riempire parzialmente un piccolo dispositivo di raffreddamento con ghiaccio per lo stoccaggio sul campo e il trasporto locale dei campioni raccolti.
Imballare tutte le forniture di raccolta nella scatola di raccolta o in un robusto contenitore resistente alle intemperie per un trasporto sicuro e uno stoccaggio consolidato. Rivedere il protocollo di raccolta e i dettagli della raccolta di campioni genetici non distruttivi prima di entrare in campo. All'arrivo sul campo, utilizzare una matita o una penna per tutte le stagioni per registrare l'ora del giorno, la data, il nome generale della proprietà, il nome o la descrizione della posizione specifica del sito del campo, la lettura GPS se disponibile e il nome completo e i ruoli di tutte le persone presenti nel taccuino da campo resistente alle intemperie.
Individuare un habitat adatto per la presenza di una pianta ospite larvale alla farfalla bersaglio specie-specifica. Utilizzando uno smartphone o una fotocamera, scatta fotografie dettagliate di tutti i siti sul campo, i luoghi di raccolta dei campioni, le piante ospiti e altre informazioni pertinenti. Utilizzare smartphone o altre fotocamere che registrano le coordinate GPS.
Cerca in modo completo tutte le parti della pianta ospite larvale come foglie, boccioli di fiori, fiori o frutti in via di sviluppo noti per essere selezionati da farfalle femmine adulte che depongono ovuli per le uova schiuse. Per la maggior parte dei Lycaenidae, cerca uova bianche tratteggiate con un buco distinto al centro simile a una ciambella da cui è emersa la larva neonata. Cerca uova non schiuse di colore più scuro, spesso verdi o bluastre, e saranno completamente intatte senza un buco nel mezzo.
Una volta individuato un uovo schiuso, indossare guanti in nitrile. Utilizzando una pinza sterile e appuntita, afferrare e estrarre delicatamente l'uovo schiuso dalla pianta ospite e posizionarlo direttamente in un tubo di microcentrifuga etichettato preriempito con tampone di lisi. Allo stesso modo, altri campioni di tessuto possono essere utilizzati ed elaborati.
Assicurarsi che tutto il materiale raccolto sia completamente immerso nel tampone di lisi all'interno di ogni provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Picchiettare la parte inferiore del tubo su una superficie dura per immergere nuovamente eventuali campioni, se necessario. Quando si raccoglie un nuovo campione, scartare i guanti in nitrile usati e sostituirli con un paio pulito.
Dopo ogni raccolta di uova, pulire accuratamente le punte delle pinze immergendole o bagnandole in una fiala di etanolo al 95% da una bottiglia di spremitura o usando salviettine imbevute di alcol. Raccogliere almeno cinque campioni per ogni appezzamento di pianta ospite per sito, ogni campione contenente da una a 20 uova, mirando a più di 50 uova in totale in un luogo, se disponibile. Raccogliere da una a 20 uova schiuse da più piante nello stesso cerotto ospite in un singolo tubo di microcentrifuga e chiudere saldamente il coperchio.
Per le specie di farfalle che utilizzano specie ospiti erbacee o legnose più grandi, raccogliere più uova da posizioni diverse sulla stessa pianta se le macchie ospiti sono limitate. Nel quaderno resistente alle intemperie, registrare l'etichetta ID univoca assegnata insieme al tipo di campione, al numero approssimativo di uova schiuse e alle informazioni sulla raccolta. Riporre la provetta chiusa per microcentrifuga con il campione di detriti di uova nella scatola di stoccaggio della microcentrifuga a 64 pozzetti.
Mantenere la scatola di stoccaggio in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio mentre si è sul campo. Collocare tutte le altre forniture di raccolta nella scatola degli attrezzi di raccolta per lo stoccaggio e il trasporto sicuri e consolidati tra i siti. Di questi 160 campioni, il DNA è stato estratto con successo da 88 con una concentrazione media di 1,67 nanogrammi per microlitro e la più alta resa di DNA è stata di 26,8 nanogrammi per microlitro.
Le concentrazioni di DNA per tipo di tessuto hanno confermato che i campioni contenenti un singolo detrito di uova avevano un solo caso di uova e i campioni contenenti più casi di uova avevano almeno due casi con il numero di casi che variava da due a 20, in media a 5,3 per campione. I materiali per raccogliere fino a 563 campioni sono stati inviati a otto scienziati della conservazione e della comunità provenienti da nove stati in tutta la gamma di specie nel Nord America orientale. I materiali sono stati inviati nell'arco di tre mesi nel corso del 2021 prima degli orari di punta dei voli locali.
Sono stati ricevuti in totale 160 campioni di tessuto dell'iride di Calephelis. È fondamentale ridurre al minimo la contaminazione incrociata tra i campioni, garantire che il campione raccolto sia completamente immerso nel tampone di lisi e registrare accuratamente l'etichetta ID univoca e i dati di raccolta per ciascun campione. Questo protocollo ha permesso un ampio dispiegamento e utilizzo da parte degli scienziati della comunità per campionare in modo non distruttivo le popolazioni esistenti di una farfalla rara per aiutare a condurre un'analisi della struttura genetica a vasta gamma.
