Questo protocollo presenta la procedura dall'amplificazione di singole cellule ai dati di segnalazione finale nei test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Questa procedura può aiutare gli spettatori ad avere una buona comprensione del flusso di lavoro sperimentale del sequenziamento PGT-A e replicare questa tecnica in un laboratorio diagnostico con una piattaforma NGS basata su semiconduttori. Inizia pipettando 25 microlitri di prodotti di amplificazione dell'intero genoma e trasferendoli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri precaricata con 25 microlitri di acqua priva di nucleasi.
Vortice e mescolare le perle di purificazione del DNA. Aliquot 50 microlitri di questa soluzione in ciascuna provetta del campione. Vortice e centrifugare brevemente per cinque secondi.
Impostare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente per il processo di legame del DNA. Inserire il tubo da centrifuga da 1,5 millilitri in una cremagliera magnetica. Quindi, attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo.
Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Evitare di pipettare le perline. Secondo il volume campione originale.
Pipettare 30 microlitri di sfere magnetiche, vortice e centrifugare brevemente per cinque secondi. Impostare il tubo per cinque minuti a temperatura ambiente per il processo di legame del DNA. Inserire le provette da centrifuga da 1,5 millimetri nella cremagliera magnetica.
Quindi, attendere che tutte le sfere magnetiche siano attratte dalla parete laterale del tubo. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante. Evitare di pipettare le perline.
Pipettare 300 microlitri di etanolo al 70% nella provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi ruotare delicatamente il tubo due volte con un angolo di 180 gradi e spostare le perline lungo la parete del tubo per un lavaggio accurato. Pipettare ed eliminare il surnatante.
Evitare di pipettare le perline. Ripetere la procedura di lavaggio una volta. Posizionare una nuova piastra di amplificazione nel sistema una volta completato il programma pulito.
Inserire i tubi di raccolta, ciascuno preriempito con 150 microlitri di soluzione di rottura due nel rotore, quindi posizionare il ponte sui tubi di raccolta. Aggiungere l'olio di reazione a metà del tubo e la soluzione di rottura dell'emulsionante a un terzo del tubo. Posizionare un nuovo filtro per la preparazione del modello su un rack di tubi con il portale di campionamento posizionato verso l'alto.
Vortice la soluzione per cinque secondi e centrifugare brevemente per cinque secondi. Quindi trasferire la soluzione nel portale del campione del filtro dopo aver pipettellato 800 microlitri tre volte. Centrifugare il tubo per diminuire le bolle prima dell'ultima iniezione.
Evitare di iniettare aria nel filtro. Iniettare 200 microlitri di olio di reazione due, seguendo la soluzione miscelata. Ruotare il portale campione del filtro verso il basso e sostituire l'adattamento di lavaggio con il filtro.
Inserire l'ago del campione nel foro centrale del coperchio del rotore e quindi premere l'ago verso il basso. Fare clic sul pulsante Esegui sullo schermo e scegliere il programma in base al kit corrispondente. Quindi selezionare Assistito per controllare tutti i passaggi.
Fare clic su Avanti fino all'avvio della corsa. La corsa richiederà circa 4,5 ore per terminare. Selezionare Avanti al termine del programma.
Il sistema avvierà un processo di centrifugazione di 10 minuti. Dopo la centrifugazione, fare clic sul pulsante Apri coperchio e spostare i tubi di raccolta nei rack. Se la procedura non passa alla fase successiva entro 15 minuti, premere sul giro finale per centrifugare nuovamente.
Rimuovere il surnatante nel tubo di raccolta, lasciando 100 microlitri di soluzione nel tubo. Mescolare il campione rimanente mediante pipettaggio e trasferire il campione nella nuova provetta da centrifuga da 1,5 millilitri contrassegnata OT. Quando si pipetta il surnatante, evitare di toccare il fondo del tubo lungo i lati. Pipettare 100 microlitri di acqua priva di nucleasi in ogni provetta di raccolta e trasferire la soluzione nella provetta OT lavata mediante pipettaggio ripetuto.
Aggiungere 600 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo OT per ottenere il volume totale di un millilitro. Vortice per 30 secondi in centrifuga a 15, 500 volte G per otto minuti. Rimuovere delicatamente il surnatante lasciando 100 microlitri di soluzione nel tubo OT.
Utilizzare la punta per eliminare completamente lo strato di olio. Aggiungere 900 microlitri di acqua priva di nucleasi, vortice per 30 secondi e centrifugare a 15, 500 volte G per otto minuti. Rimuovere il surnatante fino a quando rimangono 20 microlitri della soluzione e aggiungere la soluzione di sospensione del modello per ottenere il volume di 100 microlitri.
Quindi vortice per 30 secondi e centrifugare brevemente per due secondi. Procedere al passaggio successivo entro 12 ore dall'elaborazione del campione Caricare 100 microlitri della libreria diluita, 130 microlitri di perline C1, 300 microlitri di tre soluzioni di lavaggio del modello e 300 microlitri della soluzione di fusione nelle otto strisce del pozzetto. Installare le otto strisce del pozzetto sul modulo di arricchimento, caricare la punta del pipettaggio e posizionare il tubo della centrifuga da 200 microlitri nella posizione di raccolta.
Fare clic su Start per eseguire il programma. Pipettare 55 microlitri della soluzione campione e iniettarla nel foro del campione del chip. Impostare il chip sulla centrifuga.
Mantenere la tacca verso l'esterno e il portale del campione all'interno. Quindi, bilanciarlo con un altro chip usato e centrifugare per 10 minuti. Preparare la soluzione di caricamento come descritto nel manoscritto di testo.
Soffiare 100 microlitri di aria nella soluzione schiumogena. Pipettare ripetutamente la soluzione fino a quando le bolle sono in uno stato denso e schiumogeno e mantenere il volume di schiuma a circa 250 microlitri. Posizionare il chip sul banco dopo la centrifuga.
Iniettare 100 microlitri di schiuma nel foro del campione e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno. Quindi, centrifugare brevemente il chip per 30 secondi. Ripeti questo processo una volta.
Iniettare due volte 100 microlitri al 50% tampone di lavaggio e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione. Quindi iniettare tre volte 100 microlitri al 50% del tampone di ricottura e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno dopo ogni iniezione. Iniettare 65 microlitri al 50% tampone di reazione enzimatica, evitando bolle e rimuovere la soluzione estrusa nel portale esterno.
Stabilizzare il chip caricato a temperatura ambiente per cinque minuti e installare il chip sul portale del chip sequencer. Scegli il programma pianificato controlla le informazioni e avvia l'esecuzione. La corsa rappresentativa ha ottenuto un totale di 17,6 gigabyte di dati e il tasso di caricamento complessivo della particella della sfera ionica è stato dell'88% nei pozzetti totali del chip.
La mappa di calore ha confermato anche il carico del campione sull'area totale del chip. Il 77% delle letture totali era utilizzabile. Tutti i pozzi caricati con ISP hanno mostrato un arricchimento del 100% dei modelli in cui il 78% era clonale.
Di tutti i modelli clonali, il 97% è stato qualificato come libreria finale. La lunghezza media della lettura era di 177 coppie di basi, mentre la mediana e la modalità erano rispettivamente di 176 e 174 coppie di basi. I picchi di timina, citosina e adenina nei modelli erano circa 76 oltre la linea di taglio qualificata di 50.
In tutti i pozzi indirizzabili con ISP attivi il 99,5% si è qualificato come libreria costruita e il 20% delle librerie policlonali e di bassa qualità sono stati filtrati, mentre il 76,6% degli ISP è stato qualificato per ulteriori analisi. Il risultato della varianza del numero di copie da un singolo campione ha rappresentato una trisomia a mosaico di 182,16 megabasi di coppie di P 16,3 a Q 35,2 sul cromosoma quattro e un segmento di monosomia di 33 punti 13 coppie di megabasi da Q 11,1 a Q 13,33 sul cromosoma 22. Quando si esegue la selezione dei frammenti, gli intervalli di tempo tra le fasi devono essere modificati in base alle dimensioni dei campioni nello stesso lotto per evitare sovraccarico e mancanza di esposizione per i campioni anteriori e posteriori.
