Il metodo di isolamento del DNA proposto può servire a studiare le dinamiche del microbiota intestinale in modelli murini di malattie autoimmuni. Viene proposto un metodo più versatile, economico ed efficiente per ottenere DNA da campioni fecali paragonabili ai kit disponibili in commercio. Per iniziare, prendi ogni topo individualmente fuori dalla sua gabbia, raccogli un pellet fecale direttamente dall'ano e conservalo a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene elaborato.
Elaborare i campioni con pinze, tubi e guanti sterili e puliti. Aggiungere un pellet congelato a un tubo a vite pre-pesato da due millilitri e registrare il peso fecale in grammi, che dovrebbe essere compreso tra 0,02 e 0,05 grammi per pellet fecale. Aggiungere al pellet uno strato sottile di perle di vetro da 0,1 millimetri, 500 microlitri di tampone di lisi e 200 microlitri di solfato di dodecile di sodio al 20%.
Bead ha battuto il tubo per quattro minuti in un omogeneizzatore, seguito da tre a cinque minuti di vortice. Centrifugare i tubi per un breve periodo per eliminare le bolle e la schiuma. Per estrarre il DNA dai campioni di microbiota, trasferire 350 microlitri di surnatante del campione in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri, senza detriti.
Aggiungere 500 microlitri di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico, in un rapporto di 25:24:1, e vortice per un minuto. Dopo la centrifugazione, trasferire 180 microlitri della fase acquosa superiore in un nuovo tubo a scatto da 1,5 millilitri. Aggiungere 180 microlitri di cloroformio, capovolgere e mescolare.
Da questo, trasferire 180 microlitri della fase acquosa in un nuovo tubo a scatto. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 180 microlitri di isopropanolo freddo e 36 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari. Capovolgere un paio di volte per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
Scartare il surnatante, seguito dal lavaggio del pellet più volte con 500 microlitri di etanolo freddo al 70%. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il tubo capovolto su carta velina per 20 minuti, fino a quando il pellet diventa chiaro. Sospendi il pellet in 50 microlitri di acqua molecolare e riscalda il liquido a 37 gradi Celsius per 10 minuti per sciogliere completamente grandi pellet di DNA.
Dopo il riscaldamento, centrifugare questi tubi a 3.400 volte G per un minuto per recuperare le goccioline di condensa dal coperchio. Misurare la concentrazione e ottenere il rapporto 260/280 utilizzando uno spettrofotometro. Un rapporto per il DNA di buona qualità è generalmente compreso tra 1,8 e due.
Centrifugare i campioni preparati a 600 volte G per un minuto a temperatura ambiente, prima di congelare a meno 80 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, inviare 20 microlitri di campioni con concentrazioni comprese tra uno e 50 nanogrammi per microlitri all'Argonne National Laboratory per il sequenziamento. Il ceppo murino privo del recettore CX3CR1 ha una diversa composizione del microbiota intestinale rispetto ai topi MRL / LPR wild-type, MRL / lpr-CX3CR1 GFP / GFP, mostra differenze significative in alcuni generi, rilevanti per batteri potenzialmente patogeni come quelli nel phylum Proteobacteria.
Fare attenzione a contaminare il campione. Deve essere sterile. Inoltre, è importante pipettare con precisione quando si trasferisce il surnatante in un nuovo tubo.
Questo metodo è adatto per l'analisi molecolare come la PCR, la digestione enzimatica di restrizione o la costruzione di librerie genomiche. Nel lupus, abbiamo dimostrato una forte relazione tra il microbiota intestinale e la progressione del lupus.
