Dimostriamo la miografia isometrica o tensometrica come il protocollo gold standard per misurare la reattività di piccoli vasi sanguigni di resistenza o grandi condotti in una condizione fisiologica ben controllata. Le misure sono altamente riproducibili e affidabili. La tecnica è molto preziosa nel consentire ai ricercatori di studiare separatamente diversi strati di vasi sanguigni o studiare l'interazione tra diversi strati della parete dei vasi sanguigni contemporaneamente.
A dimostrare la procedura sarà Robert Folk, lo specialista del laboratorio di ricerca del mio laboratorio. Inizia accendendo il bagno d'acqua e impostandolo a 37 gradi Celsius. Posizionare due becher etichettati in modo appropriato nel bagno d'acqua, uno con 600 millilitri di soluzione HEPES-PSS e uno con 150 millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio.
Aerare un becher contenente 300 millilitri di soluzione HEPES-PSS con gas carbogeno per almeno 10 minuti. Aggiungere 30 millilitri della soluzione HEPES-PSS aerata in una provetta da centrifuga da 50 millilitri, etichettare in modo appropriato e posizionarla sul ghiaccio. Conservare la soluzione HEPES-PSS aerata rimanente su ghiaccio da utilizzare durante il processo di dissezione aortica.
Accendere l'unità miografica a quattro camere a 5 millilitri di soluzione HEPES-PSS per ciascuna camera del miografo e impostare il calore a 37 gradi Celsius. Lasciare che la soluzione in ciascuna camera venga aerata per 30 minuti e controllare che le camere abbiano raggiunto i 37 gradi Celsius desiderati. Accendere l'hardware e il computer di acquisizione dati del miografo.
Trasferire la gabbia toracica asportata dai topi eutanizzati in una capsula di Petri rivestita di elastomero siliconico trasparente riempita con tampone HEPES-PSS aerato ghiacciato e fissarla su entrambi i lati. Sotto il microscopio, tagliare delicatamente e rimuovere il cuore e l'aorta attaccata dalla gabbia toracica e trasferire in un piatto rivestito di elastomero siliconico pulito, quindi rimuovere delicatamente il tessuto connettivo grasso e il sangue coagulato dall'aorta. Utilizzando piccole forbici affilate, sezionare e isolare l'intera aorta a partire dalla zona dell'arco fino al fondo dell'aorta discendente.
Tagliare l'aorta sezionata in quattro segmenti di 2 millimetri ciascuno. Usa il mini-righello all'interno del piatto come riferimento. Nelle camere contenenti già 5 millilitri di tampone HEPES-PSS riscaldato e aerato, far scorrere con attenzione ciascuno dei segmenti aortici da 2 millimetri sui due perni di montaggio usando una pinza.
Quando si riposiziona la camera nell'unità miografa, spostare lentamente i perni ruotando il micrometro in senso antiorario in modo che il segmento aortico non scivoli via dai perni. Riportare ogni camera miografica all'unità e iniziare ad aerare le camere a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Scolare le camere e aggiungere 5 millilitri di soluzione HEPES-PSS fresca, calda e aerata a ciascuna camera.
Se necessario, regolare nuovamente le misurazioni della forza per leggere la tensione ottimale di 6 millinewton. Riposare il tessuto per altri 15-20 minuti. Aprire il software di acquisizione dati.
Modificare i numeri di tracciamento da 50 a 1 a 500 a 1 e premere Start. Prima di iniziare un nuovo esperimento, assicurarsi di aggiungere l'etichetta appropriata sul software di acquisizione dati. Scolare le camere ancora una volta prima di aggiungere 5 millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio a ciascuna camera.
Drenare nuovamente le camere non appena la risposta contrattile alla soluzione ad alto contenuto di potassio raggiunge un plateau per la generazione di forza. Lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS tre volte. Aggiungere 5 millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio in ciascuna camera.
Drenare le camere non appena la risposta contrattile alla soluzione ad alto contenuto di potassio raggiunge un plateau per la generazione di forza e lavare il tessuto tre volte con HEPES-PSS, quindi riposare il tessuto per 15-20 minuti. Pre-contrarre i segmenti aortici con l'agente vasocostrittore PE ad una dose inferiore alla massima. Consentire alla curva di contrazione indotta da PE di raggiungere un plateau per lo sviluppo della tensione.
Aggiungere un plateau di sviluppo della tensione al PE a 5 microlitri di dosi crescenti di soluzioni di stock di lavoro di acetilcolina a intervalli di 3 minuti per stabilire concentrazioni finali di acetilcolina da 50 picomolar a 10 micromolari nella camera del miografo come descritto nel manoscritto del testo. Dopo aver completato l'esperimento dose-risposta, drenare le camere, lavare i segmenti aortici con soluzione HEPES-PSS calda e aerata tre volte e riposare i tessuti per 30 minuti. Dopo aver fatto riposare i segmenti aortici per 30 minuti, drenare le camere e aggiungere una soluzione fresca e calda ad alto contenuto di potassio a ciascuna camera, quindi drenare le camere e lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS quando la risposta di contrazione alla soluzione ad alto contenuto di potassio raggiunge un plateau F come dimostrato in precedenza.
Pre-incubare i segmenti aortici con L-NAME aggiungendo 10 microlitri della soluzione madre di lavoro da 100 millimolari preparata per valutare il contributo della produzione di ossido nitrico alla vasorilassamento indotta da acetilcolina osservata. Senza rimuovere il nome L, aggiungere la dose sub-massima di PE alla camera per indurre la contrazione aortica. Attendere che la curva di contrazione indotta da PE raggiunga un plateau per lo sviluppo della tensione, quindi aggiungere acetilcolina alla camera del miografo per ottenere una concentrazione finale di 500 nanomolari.
Attendere alcuni minuti per registrare eventuali cambiamenti nello sviluppo della forza fino a quando il plateau formato è stabile. Scolare le camere e lavare il tessuto con una soluzione HEPES-PSS aerata calda tre volte. Posizionare la camera del miografo sotto il microscopio e passare delicatamente un piccolo filo attraverso il lume dell'aorta.
Spostare delicatamente il filo attraverso il lume per un breve periodo. Tagliare l'aorta in anelli aortici di 2 millimetri e montare quegli anelli sulla camera del miografo. Impostare la tensione ottimale a 6 millinewton e lasciare riposare il tessuto per 30 minuti in tampone HEPES-PSS caldo aerato, quindi drenare le camere e aggiungere 5 millilitri di soluzione HEPES-PSS calda fresca a caldo in ciascuna camera.
Azzerare la forza per tutte le camere del miografo e ruotare lentamente il micrometro in senso antiorario per aumentare la distanza tra i pin fino a quando la forza registrata raggiunge la tensione ottimale desiderata per l'aorta del topo. Premere il tessuto per altri 15-20 minuti alla tensione ottimale, quindi drenare nuovamente le camere prima di aggiungere 5 millilitri di soluzione ad alto contenuto di potassio a ciascuna camera. Drenare nuovamente le camere e lavare il tessuto con la soluzione HEPES-PSS tre volte una volta che la risposta di contrazione alla soluzione di ioni ad alto contenuto di potassio raggiunge un plateau.
Riposare il tessuto per 15-20 minuti, quindi pre-contrarre i segmenti aortici con PE, l'agente vasocostrittore. Quando la forza indotta da PE raggiunge un plateau, aggiungere la concentrazione sub-massima di acetilcolina alla camera del miografo per ottenere una concentrazione finale di 500 nanomolari. Attendere 3 minuti per assicurarsi che il plateau registrato per lo sviluppo della forza indotta da PE non cambi prima di terminare l'esperimento.
L'integrità e la vitalità di ciascun recipiente isolato sono state valutate registrando la generazione della forza contrattile. Il picco della forza registrata è stato successivamente utilizzato per normalizzare la generazione di forza per lo stesso segmento in risposta agli agonisti. Le misurazioni di vasorilassamento mediate dall'endotelio hanno rappresentato la contrazione mediata dalla muscolatura liscia e la generazione di forza.
Quando la contrazione indotta da PE ha raggiunto un plateau, dosi crescenti di acetilcolina hanno raggiunto il massimo vasorilassamento nel segmento isolato. L'inibitore dell'ossido nitrico L-NAME ha completamente bloccato la vasorilassazione indotta da acetilcolina nell'aorta precontratta, indicando che l'acetilcolina induce vasorilassamento aortico attraverso l'aumento della produzione di ossido nitrico. Inoltre, la rimozione dello strato endoteliale dai segmenti aortici ha anche bloccato la vasorilassazione indotta da acetilcolina sottolineando il ruolo dell'endotelio nel rilassamento dei vasi sanguigni.
Assicurarsi di essere delicati durante la manipolazione, la pulizia e la dissezione del vaso sanguigno. È fondamentale aggiungere gli agonisti farmacologici e gli inibitori con attenzione per non disturbare gli anelli dei vasi sanguigni montati sulle camere del miografo. Le informazioni possono aiutare a progettare esperimenti per esplorare potenziali approcci terapeutici per affrontare la disfunzione degli strati di uno specifico vaso sanguigno.
