Gli studi funzionali dei geni della Rickettsia sono cruciali per comprendere il loro ruolo nella patogenesi, quindi abbiamo bisogno di metodi affidabili per alterare i geni in modo controllato. Il nostro protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre DNA esogeno in batteri intracellulari obbligati del genere Rickettsia, permettendoci così di studiare gli effetti del DNA introdotto. A dimostrare la procedura insieme a me oggi sarà Lisa Price, una ricercatrice del Dr.Munderloh e del laboratorio del Dr.Kurtti.
Per iniziare, preparare una coltura cellulare ISE6 infetta da Rickettsia parkeri dal 90 al 100% come descritto nel testo. Quindi, per determinare il tasso di infezione mediante colorazione di Giemsa, diluire la sospensione cellulare in un rapporto di 1:5 con mezzo completo e depositare 100 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino da microscopio mediante centrifugazione a 113 G per cinque minuti. Dopo aver lasciato asciugare il vetrino all'aria, fissarlo con metanolo assoluto per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi, incubare il vetrino e la macchia di Giemsa per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, sciacquare il vetrino in acqua e, una volta asciutto, visualizzarlo al microscopio ottico con obiettivi a olio. Determinare la percentuale di cellule infette contando le cellule infette e non infette.
Per preparare la Rickettsia parkeri priva di cellule, versare circa 0,2 millilitri di graniglia sterile da 60 a 90 in carburo di silicio in due tubi sterili da microcentrifuga da due millilitri e mettere da parte i tubi. Da un pallone infetto da Rickettsia parkeri precedentemente inoculato contenente cinque millilitri di mezzo, rimuovere due millilitri del mezzo, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Quindi, risospendere le celle con i restanti tre millilitri del mezzo.
Dividere equamente questa sospensione tra i due tubi di graniglia di carburo di silicone preparati e vortice il tubo ad alta velocità per 30 secondi. Quindi, metterli sul ghiaccio. Quindi, preparare una siringa luer lock sterile da cinque millilitri estendendo lo stantuffo e inserire l'estremità dello stantuffo in una base di polistirene utilizzata per contenere tubi conici da 15 millilitri.
Utilizzando una pipetta Pasteur barriera da due millilitri azionata con un bulbo di gomma, rimuovere con cura il surnatante delle celle del vortice senza aspirare alcuna graniglia. Quindi, inserire la punta della pipetta nell'apertura del mozzo della siringa ed espellere il contenuto nella siringa con una leggera pressione. Successivamente, filtrare la coltura di Rickettsia parkeri in tubi sterili da 1,5 millilitri attraverso un filtro sterile a due micrometri montato sul mozzo della siringa e centrifugare i tubi a 13.600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver rimosso il surnatante, lavare il pellet cellulare due volte con 1,2 millilitri di soluzione di saccarosio ghiacciata da 300 millimol. Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante tra un lavaggio e l'altro. Al termine della centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in pool con 100-150 microlitri di soluzione di saccarosio ghiacciata per due o tre campioni di trasformazione, rispettivamente.
Quindi, dividere il campione in aliquote da 50 microlitri in provette da microcentrifuga sterili da 1,5 microlitri pre-refrigerate. Per la trasformazione a tre microgrammi di DNA plasmidico pRAM18sSFA privo di endotossine in ciascuna provetta contenente 50 microlitri di Rickettsia parkeri su ghiaccio e mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Trasferire la miscela in una cuvetta di elettroporazione sterile pre-refrigerata con una dimensione dello spazio di 0,1 centimetri.
Picchiettare delicatamente la cuvetta per distribuire uniformemente la miscela e incubare sul ghiaccio per 10-30 minuti. Nel frattempo, rimuovere il terreno da un pallone di coltura cellulare ISE6 completamente confluente precedentemente coltivato e risospendere lo strato cellulare risciacquando delicatamente le cellule con 1,5 millilitri di terreno fresco contenente bicarbonato di sodio e tampone HEPES. Dopo aver generato una sospensione cellulare omogenea, trasferire l'intero volume in una singola provetta da microcentrifuga sterile da due millilitri.
Successivamente, elettroporare la miscela di DNA plasmidico di Rickettsia parkeri e plasmide usando un elettroporatore. Dopo l'elettroporazione, utilizzare una pipetta sterile estesa a punta fine per trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare ISE6 nella cuvetta e pipettare delicatamente su e giù per recuperare la Rickettsia parkeri elettroporata. Quindi, trasferire il contenuto della cuvetta nel tubo da due millilitri contenente il resto della sospensione cellulare ISE6.
Quindi, centrifugare il campione a temperatura ambiente, prima a 700 G per due minuti per abbattere le cellule ISE6 e poi a 13.600 G per un minuto per abbattere la Rickettsia. Incubare il tubo a 34 gradi Celsius per 15 minuti a un'ora. Dopo l'incubazione, trasferire il contenuto risospeso di una trasformazione in un matraccio di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati contenente 3,5 millilitri di terreno fresco con bicarbonato di sodio e tampone HEPES.
Agitare il matraccio per distribuire uniformemente il composto e incubare a 34 gradi Celsius. Dopo 16-24 ore, aggiungere 10 microlitri ciascuno di spectinomicina e streptomicina nel pallone incubato. Scuotere il pallone per mescolare uniformemente gli antibiotici nel mezzo prima di restituirlo all'incubatrice.
La propagazione riuscita delle cellule selvatiche di Rickettsia parkeri e ISE6 è stata evidente dalla colorazione di Giemsa. Sono visibili i nuclei delle cellule ISE6 colorate di viola scuro con Giemsa nel Rickettsi intracellulare ed extracellulare. La trasformazione di Rickettsia parkeri che esprime la proteina di fluorescenza rossa nelle cellule ISE6 è stata confermata dalla microscopia confocale dopo sette giorni di incubazione.
Un sostanziale aumento del tasso di infezione è stato osservato dopo 10 giorni. Mantenere tutto sterile durante l'intera procedura. Presta attenzione ai dettagli e sii paziente, poiché alcune specie di Rickettsia impiegano molto tempo per trasformarsi, in particolare gli endosimbionti a crescita lenta.
Questo protocollo ha permesso lo studio di molteplici aspetti della biologia della Rickettsia e delle loro interazioni con i loro vettori artropodi e gli ospiti dei mammiferi. Ad esempio, Rickettsi fluorescente che esprime proteine sono state utilizzate per tracciare la motilità e le interazioni delle cellule di zecca simbionti.
