Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia ceca delle scienze RVO 68378050, LM2018126 Centro ceco per la fenogenomica fornito da MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II di MEYS e ESIF) e OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (qualità e capacità superiori per i modelli transgenici di MEYS e FESR). Inoltre, questo studio ha ricevuto finanziamenti dall'ONG "Association of Gene Therapy (ASGENT)", dalla Repubblica Ceca (https://asgent.org/) e dal Centro cec LM2023036 o di fenogenomica fornito dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca.

Validazione di un modello murino della sindrome di Angelman mediante test comportamentali

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I modelli di AS creati in diversi ceppi murini sono comunemente convalidati con test dello stato emotivo, delle funzioni motorie e delle capacità cognitive degli animali per facilitare il confronto con i sintomi umani31,32. Un deficit motorio nei modelli di AS è il risultato più consistente in tutti i laboratori, seguito da uno stato emotivo invariato dei mutanti e dalle difficoltà a costruire i nidi31,32,33<sup class="xref"...

La sindrome di Angelman (AS) è una rara malattia del neurosviluppo. L'origine genetica più comune della SA è una grande delezione della regione 15q11-q13 del cromosoma di origine materna, che si trova in quasi il 74% dei pazienti1. La delezione di questa regione provoca la perdita di UBE3A, il principale gene causativo della SA che codifica per l'ubiquitina ligasi E3. L'allele paterno del gene UBE3A nei neuroni viene silenziato in un processo noto come imprinting. Di conseguenza, l'imprinting paterno del gene consente solo l'espressione materna nel sistema nervoso centrale (SNC)2. Pertanto, la delezione del gene UBE3A dal cromosoma di origine materna porta allo sviluppo dei sintomi della SA. Nell'uomo, la SA si manifesta intorno ai 6 mesi di età, con ritardo dello sviluppo che persiste in tutte le fasi dello sviluppo e provoca gravi sintomi debilitanti nei soggetti affetti 3,4. I sintomi principali del disturbo includono il deficit delle capacità motorie fini e grossolane, tra cui andatura atassica a scatti, grave compromissione del linguaggio e disabilità intellettiva. Circa l'80% dei pazienti con SA soffre anche di disturbi del sonno ed epilessia. Ad oggi, l'unico trattamento disponibile sono i farmaci sintomatici, che riducono le crisi epilettiche e migliorano la qualità del sonno1. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali robusti con fenotipi comportamentali riproducibili insieme a una raffinata analisi della fenotipizzazione sarà essenziale per chiarire i meccanismi fisiopatologici del disturbo e scoprire farmaci e trattamenti efficaci.
La complessità del disturbo umano che colpisce il sistema nervoso centrale richiede che gli organismi modello possiedano un genoma, una fisiologia e un comportamento comparabili. I topi sono popolari come organismi modello a causa del loro breve ciclo riproduttivo, delle piccole dimensioni e della relativa facilità di modifica del DNA. Nel 1984, Paul Willner ha proposto tre criteri di base per la validazione del modello di malattia: il costrutto, il volto e la validità predittiva, che vengono utilizzati per determinare il valore del modello5. Semplicemente, la validità del costrutto riflette i meccanismi biologici responsabili dello sviluppo del disturbo, la validità del volto ne ricapitola i sintomi e la validità predittiva descrive la risposta del modello ai farmaci terapeutici.
Per aderire ai principi di cui sopra, abbiamo scelto l'eziologia genetica più comune, una grande delezione del locus materno 15q11.2-13q che include il gene UBE3A, per creare topi modello AS. Abbiamo usato la tecnica CRISPR/Cas9 per eliminare una regione lunga 76.225 bp che copre l'intero gene UBE3A, comprendendo sia gli elementi codificanti che quelli non codificanti del gene, nei topi provenienti da un background C57BL/6N6. Abbiamo quindi allevato gli animali per ottenere topi eterozigoti UBE3A+/−. Per la validazione facciale del modello, abbiamo utilizzato animali provenienti da incroci di femmine UBE3A+/− e maschi wild-type per ottenere la progenie UBE3A+/- (ceppo denominato C57BL/6NCrl-UBE3A<em1(IMPC)Ccpcz>/Ph e successivamente assegnato come UBE3A mGenedel/+) e compagni di cucciolata di controllo. Abbiamo testato le loro capacità motorie fini e grossolane, l'emotività e l'affetto per ricapitolare i sintomi principali dell'AS. In un precedente articolo, abbiamo anche valutato le funzioni cognitive degli animali, poiché i pazienti con AS soffrono anche di disabilità intellettiva6. Tuttavia, non abbiamo riscontrato disturbi cognitivi nei topiUBE3A mGenedel/+, forse a causa della giovane età degli animali al momento del test7. L'esame successivo degli animali più anziani, di circa 18 settimane, ha rivelato un deficit nella flessibilità comportamentale durante l'apprendimento inverso nel paradigma della preferenza di luogo. Tuttavia, la complessità delle apparecchiature impiegate per questa analisi richiede un modulo metodologico separato e non è incluso in questa sede.
I test comportamentali qui presentati appartengono agli strumenti di fenotipizzazione più comuni nella ricerca genetica, grazie al loro elevato valore predittivo e alla sufficiente validità del costrutto 8,9,10. Abbiamo utilizzato questi test per convalidare un modello murino di SA ricapitolando i sintomi principali della malattia umana in modo riproducibile e indipendente dall'età. L'emotività dell'animale è stata valutata nei test di labirinto elevato e campo aperto. Entrambi questi test si basano sul conflitto approccio-evitamento, in cui gli animali esplorano un nuovo ambiente in cerca di cibo, riparo o opportunità di accoppiamento, evitando contemporaneamente i compartimenti ansiogeni11. Inoltre, il test in campo aperto viene utilizzato per testare l'attività locomotoria di un topo8. Il test della sospensione della coda è ampiamente utilizzato nella ricerca sulla depressione per lo screening di nuovi farmaci antidepressivi o fenotipi simili alla depressione in modelli murini knockout12. Questo test valuta la disperazione che gli animali sviluppano nel tempo in una situazione ineluttabile. L'apprendimento motorio e le caratteristiche dettagliate dell'andatura sono state determinate rispettivamente sul rotarod e nel DigiGait. La resistenza dell'animale sull'asta accelerante caratterizza le sue capacità di equilibrio e coordinazione del movimento, mentre l'analisi dettagliata dei modelli di passo di un topo è una valutazione sensibile delle menomazioni neuromuscolari connesse a molti disturbi neurogenerativi del movimento13,14,15. Il test di triturazione del nido fa parte della metodologia standard per rilevare il comportamento impulsivo nei roditori e, poiché utilizza il comportamento naturale della costruzione dei roditori, indica il benessere dell'animale16,17.
La dimensione dei gruppi sperimentali è stata il risultato di un compromesso per soddisfare le esigenze della regola 3R e l'uso efficiente delle prestazioni di allevamento delle colonie. Tuttavia, per ottenere potere statistico, i gruppi avevano non meno di 10 individui, a causa della creazione di un numero sufficiente di coppie nidificanti. Purtroppo, le prestazioni riproduttive non sempre hanno portato a un numero sufficiente di animali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cages, individually ventilated</td>
			<td>Techniplast</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiGait</td>
			<td>Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level 
			Unit 110 
			Framingham, MA 01701, USA</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA Nestlet squares</td>
			<td>Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK</td>
			<td>Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.</td>
			<td>Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse chow</td>
			<td>Altramion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotarod</td>
			<td>TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 
			12489 Berlin, Germany</td>
			<td>Equipment was tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Suspension Test</td>
			<td>Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles 
			FRANCE</td>
			<td>Reference: BIO-TST5</td>
			<td>Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore medical tape</td>
			<td>Medical M, Ltd.</td>
			<td>P-AIRO1291</td>
			<td>The tape used to attach an animal to the hook by its tail.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewer - Video Tracking System</td>
			<td>Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 
			53111 Bonn, Germany</td>
			<td>Equipment with software were tendered, no catalogue&#160; number was provided, nor could be find on company&#39;s web site</td>
			<td>Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,&#160; 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

behavioral characterization of an angelman syndrome mouse model

Questo manoscritto descrive una batteria di test comportamentali disponibili per caratterizzare i fenotipi simili alla sindrome di Angelman (AS) in un modello murino consolidato di AS. Utilizziamo il paradigma di apprendimento rotarod, l'analisi dettagliata dell'andatura e il test di costruzione del nido per rilevare e caratterizzare le disabilità motorie degli animali. Testiamo l'emotività animale in campo aperto e nei test a labirinto sopraelevati, nonché l'affetto nel test di sospensione della coda. Quando i topi AS vengono testati nel test in campo aperto, i risultati devono essere interpretati con cautela, poiché le disfunzioni motorie influenzano il comportamento del topo nel labirinto e alterano i punteggi di attività.
La riproducibilità e l'efficacia dei test comportamentali presentati è già stata convalidata in diverse linee murine Uba3a indipendenti con diverse varianti di knockout, stabilendo questa serie di test come un eccellente strumento di validazione nella ricerca sulla SA. I modelli con il costrutto e la validità del volto pertinenti giustificheranno ulteriori indagini per chiarire la fisiopatologia della malattia e garantire lo sviluppo di trattamenti causali.

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disease. The most common genetic origin of AS is a large deletion of the 15q11-q13 region of the maternally-derived chromosome, which is found in nearly 74% of patients1. Deletion of this region causes the loss of UBE3A, the main causative gene of AS that encodes an E3 ubiquitin ligase. The paternal allele of the UBE3A gene in neurons is silenced in a process known as imprinting. As a consequence, paternal imprinting of the gene allows only maternal expression in the central nervous system (CNS)2. Therefore, UBE3A gene deletion from the maternally-derived chromosome leads to the development of AS symptoms. In humans, AS manifests at around 6 months of age, with developmental retardation that persists throughout all developmental stages and results in severe debilitating symptoms in affected individuals3,4. The core symptoms of the disorder include the deficit of fine and gross motor skills, including jerky ataxic gait, serious speech impairment, and intellectual disability. Approximately 80% of AS patients also suffer from sleep disturbances and epilepsy. To date, the only available treatment are symptomatic drugs, which reduce epileptic seizures and improve sleep quality1. Therefore, the development of robust animal models with reproducible behavioral phenotypes alongside refined phenotyping analysis will be essential to elucidate the pathophysiological mechanisms of the disorder and discover effective medications and treatments.
The complexity of the human disorder affecting the CNS demands model organisms to possess a comparable genome, physiology, and behavior. Mice are popular as a model organism due to their short reproductive cycle, small size, and relative ease of DNA modification. In 1984, Paul Willner proposed three basic disease model validation criteria: the construct, face, and predictive validity, which are used to determine the model&#39;s value5. Simply, construct validity reflects the biological mechanisms responsible for the disorder development, face validity recapitulates its symptoms, and predictive validity describes the model response to therapeutic drugs.
To adhere to the above principles, we have chosen the most common genetic etiology, a large deletion of the maternal 15q11.2-13q locus including the UBE3A gene, to create AS model mice. We used the CRISPR/Cas9 technique to delete a 76,225 bp long region spanning the entire UBE3A gene, encompassing both the coding and non-coding elements of the gene, in mice from a C57BL/6N background6. We then bred the animals to obtain UBE3A+/&#8722; heterozygous mice. For face validation of the model, we used animals from crosses of UBE3A+/&#8722; females and wild-type males to gain UBE3A+/- progeny (strain named C57BL/6NCrl-UBE3A&#60;em1(IMPC)Ccpcz&#62;/Ph and later assigned as UBE3AmGenedel/+) and control littermates. We tested their fine and gross motor skills, emotionality, and affect to recapitulate core AS symptoms. In a previous article, we also evaluated the animals&#39; cognitive functions, as AS patients also suffer from intellectual disability6. However, we found no cognitive impairments in UBE3AmGenedel/+ mice, perhaps due to the young age of the animals at the time of testing7. Later examination of the older animals, around 18 weeks old, revealed a deficit in behavioral flexibility during reversal learning in the place preference paradigm. However, the complexity of the employed equipment for this analysis requires a separate methodological module and it is not included here.
The behavioral tests presented here belong to the common phenotyping tools in genetic research, thanks to their high predictive value and sufficient construct validity8,9,10. We used these tests to validate a mouse model of AS by recapitulating core symptoms of the human disease in a reproducible, age-independent manner. The emotionality of the animal was evaluated in the elevated plus maze and open field tests. Both of these tests are based on the approach-avoidance conflict, where animals explore a new environment in search of food, shelter, or mating opportunities while simultaneously avoiding anxiogenic compartments11. Additionally, the open field test is used to test a mouse&#39;s locomotor activity8. The tail suspension test is widely used in depression research to screen for new antidepressant drugs or depressive-like phenotypes in mouse knockout models12. This test evaluates the despair that animals develop over time in an inescapable situation. Motor learning and detailed gait characteristics were determined on the rotarod and in DigiGait, respectively. Animal endurance on the accelerating rod characterizes its balance and movement coordination skills, while detailed analysis of a mouse&#39;s step patterns is a sensitive evaluation of neuromuscular impairments connected to many neurogenerative movement disorders13,14,15. The nestlet shredding test is part of the standard methodology for detecting impulsive behavior in rodents, and since it utilizes natural rodent building behavior, it indicates the animal&#39;s well-being16,17.
The size of the experimental groups was a result of a compromise to meet the 3R rule demands and efficient usage of colony breeding performance. However, to obtain statistical power, the groups had no fewer than 10 individuals, due to the establishment of a sufficient amount of breeding pairs. Unfortunately, breeding performance did not always result in a sufficient number of animals.

Autore in primo piano: una batteria di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino della sindrome di Angelman 

Caratterizzazione comportamentale di un modello murino con sindrome di Angelman

Sopraelevato più labirinto e test in campo aperto I test EPM e OF utilizzano la naturale tendenza dei roditori ad esplorare nuovi ambienti18,19. L'esplorazione è governata da un conflitto di avvicinamento-evitamento, in cui i roditori scelgono tra l'esplorazione di un nuovo ambiente e l'evitare possibili pericoli. Gli animali esplorano luoghi sconosciuti alla ricerca di riparo, contatto sociale o foraggiamento. Tuttavia, i nuovi luoghi posso...

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Questo manoscritto presenta una serie di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino con sindrome di Angelman.

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...

Il nostro obiettivo è quello di chiarire i ruoli fisiologici dei geni utilizzando i topi come modello sperimentale. Ci concentriamo anche sullo sviluppo di modelli murini di malattie specifiche che gli scienziati possono utilizzare per studiare la causa della malattia e sviluppare trattamenti efficaci. Un esempio di tale attività è il modello murino della sindrome di Angelman.Probabilmente, la nuova tecnologia più promettente con potenziale è l'integrazione dell'intelligenza artificiale basata su tecniche di deep learning nella ricerca sugli animali. Questo approccio può essere utilizzato per monitorare direttamente il comportamento degli animali nella gabbia domestica senza la necessità che lo sperimentatore disturbi gli animali. La sfida più grande negli studi comportamentali attualmente è la riproducibilità.Pertanto, introduciamo una batteria di test che convalidano la sindrome di Angelman del modello in un modo che non dipende dall'età o dalla specie del modello. Utilizziamo test comportamentali consolidati per convalidare il nostro modello AS. Tuttavia, con il nuovo approccio per lo sviluppo del modello che assomiglia molto alla condizione umana con una grande delezione.Utilizzando la tecnologia CRISPR, abbiamo eliminato l'intero gene UBE3A dal genoma del topo. A differenza di altri modelli in cui l'eliminazione è limitata a 3 KB. Stiamo lavorando allo sviluppo di una terapia genetica che potrebbe ripristinare i sintomi in un modello murino.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

1.7K Views.  Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences. Il nostro obiettivo è quello di chiarire i ruoli fisiologici dei geni utilizzando i topi come modello sperimentale. Ci concentriamo anche sullo sviluppo di modelli murini di malattie specifiche che gli scienziati possono utilizzare per studiare la causa della malattia e sviluppare trattamenti efficaci. Un esempio di tale attività è il modello murino della sindrome di Angelman.Probabilmente, la nuova tecnologia più promettente con potenziale è l'integrazione dell'intelligenza artif...

Video: Autore in primo piano: una batteria di test comportamentali altamente riproducibili per convalidare un modello murino della sindrome di Angelman 

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.