Vorremmo ringraziare il servizio di Medicina Interna per Piccoli Animali della WSU (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) e la coordinatrice degli studi clinici della WSU VTH Valorie Wiss per il loro supporto nel reclutamento dei casi e nella raccolta di campioni da parte di cittadini scienziati (donatori di pazienti). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Ufficio del Direttore, dal National Institutes Of Health (K01OD030515 e R21OD031903 to Y.M.A.) e dalla Società Giapponese per la Promozione della Scienza Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 to I.N.). La Figura 1A e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.

Istituzione della morfogenesi 3D in un sistema Gut-on-a-Chip IBD canino

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Questo studio segna la dimostrazione pionieristica della compatibilità degli organoidi intestinali canini con lo sviluppo di un modello Gut-on-a-Chip IBD canino. L'integrazione di organoidi intestinali e colture monostrato derivate da organoidi in un sistema microfluidico (i.e., sistema Gut-on-a-Chip) ha ulteriormente evoluto la tecnologia, consentendo la creazione di modelli intestinali in vitro che imitano da vicino le dinamiche fisiologiche e sono più rappresentativi delle condizioni biologiche. In particolare, poiché ci sono pochissime segnalazioni di colture Gut-on-a-Chip che utilizzano organoidi derivati da IBD negli esseri umani, l'attuale studio che utilizza Gut-on-a-Chip derivato da IBD canine può fornire approfondimenti principali nello studio delle IBD negli esseri umani.
Il successo dello sviluppo della morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale canino su un Gut-on-a-Chip richiede un'attenta attenzione a diversi passaggi critici. In primo luogo, la superficie idrofobica dei canali microfluidici PDMS può impedire l'adesione dell'ECM e il successivo attacco cellulare, rendendo necessaria l'attivazione superficiale del PDMS prima del rivestimento dell'ECM e della semina cellulare (vedere la sezione 1 del protocollo). Per ottenere una coltura monostrato stabile, la rimozione delle cellule non attaccate in eccesso è fondamentale dopo l'attacco cellulare (fasi 4.6-4.7 del protocollo). Inoltre, la stimolazione dinamica, come il flusso medio costante e il movimento del vuoto simile a quello peristaltico, è necessaria per la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale (fase 5.2 del protocollo). Un'attenta manipolazione è essenziale per evitare bolle d'aria nel microcanale durante qualsiasi fase della coltura Gut-on-a-Chip.
Se si riscontra una scarsa semina delle cellule nel Gut-on-a-Chip, potrebbe essere dovuto a un basso numero di cellule o a uno scarso attaccamento delle cellule. Per risolvere il problema del basso numero di cellule, è importante ispezionare lo stato di salute degli organoidi intestinali preparati osservando la loro crescita in Matrigel. La vitalità cellulare può essere valutata mediante colorazione blu di tripano dopo la dissociazione cellulare per garantire che non più del 20% delle cellule sia morto. Se il numero di cellule vitali è insufficiente, si può tentare di ottimizzare le condizioni del terreno organoide. Un'altra possibilità è la dissociazione incompleta degli organoidi, con conseguente eccesso di grumi cellulari più grandi di 70 μm che rimangono intrappolati dal filtro. Per risolvere questo problema, un'opzione consiste nell'estendere la durata del pipettaggio durante la dissociazione cellulare. In alternativa, la provetta conica da 15 ml può essere agitata delicatamente ogni minuto durante il trattamento con una proteasi simile alla tripsina. Uno scarso attaccamento delle cellule al Gut-on-a-Chip può essere dovuto a un rivestimento ECM improprio. Durante il processo di rivestimento, si consiglia di verificare attentamente la presenza di bolle d'aria e prevenirne la formazione aggiungendo delicatamente altra soluzione di rivestimento secondo necessità. Il sovraffollamento delle celle e l'incapacità di lavare via le cellule non attaccate possono portare a un monostrato iniziale insufficiente. In tal caso, è possibile applicare una leggera pulsazione quando si spinge lo stantuffo della siringa. Questi passaggi per la risoluzione dei problemi possono aiutare a identificare e risolvere i problemi durante il processo di coltura Gut-on-a-Chip.
Sebbene questa piattaforma Gut-on-a-Chip consenta la creazione di strati epiteliali 3D ondulati, riconosciamo la necessità di un'ulteriore complessità biologica per replicare completamente il microambiente intestinale. È fondamentale considerare le interazioni tra cellule epiteliali e mesenchimali, la deposizione di ECM per la rigenerazione 3D e la presenza di caratteristiche di cripto-villi che stabiliscono una nicchia di cellule staminali adatta. Le cellule stromali, come i fibroblasti, svolgono un ruolo fondamentale nella produzione di proteine ECM e nella regolazione della morfogenesi intestinale34,35,36. L'inclusione di cellule mesenchimali in questo modello ha il potenziale per migliorare sia la morfogenesi che l'efficienza dell'attacco cellulare. Gli strati endoteliali, che comprendono la vascolarizzazione capillare e i vasi linfatici, svolgono un ruolo cruciale nel governare il trasporto molecolare e il reclutamento delle cellule immunitarie37,38. L'inclusione di cellule immunitarie derivate dal paziente potrebbe essere essenziale nella modellazione delle malattie intestinali in quanto consente di dimostrare l'interazione tra immunità innata e adattativa, nonché l'instaurazione di un'immunità tessuto-specifica39. Dopo il completamento della morfogenesi 3D su Gut-on-a-Chip, il terreno di coltura organoide può essere modificato in un terreno di differenziazione organoide. Questo può essere un approccio praticabile per indurre un'ulteriore differenziazione cellulare, a seconda degli obiettivi sperimentali.
L'imaging della microarchitettura 3D in situ è impegnativo a causa della lunga distanza di lavoro richiesta, che può essere superata con un obiettivo a lunga distanza. Inoltre, i metodi di microfabbricazione e incollaggio strato per strato rendono difficile l'accesso agli strati superiori per l'esame con SEM. Per l'attuale design Gut-on-a-Chip, è necessaria una pompa a siringa per microdispositivo Gut-on-a-Chip, occupando lo spazio dell'incubatore di CO2 e impedendo esperimenti su larga scala. Sono necessarie innovazioni per aumentare la scalabilità per una piattaforma user-friendly e uno screening ad alto rendimento.
Questi protocolli attuali consentono lo sviluppo spontaneo di strati epiteliali 3D in vitro, superando i limiti dei tradizionali organoidi 3D, dei monostrati 2D e dei sistemi di coltura statici di microdispositivi. Questo microambiente intestinale dinamico in vitro può essere controllato introducendo co-colture di diversi tipi cellulari. Studi precedenti hanno esplorato metodi per manipolare il microambiente Gut-on-a-Chip, tra cui la co-coltura del microbioma intestinale14,23 e delle cellule mononucleate periferiche30. Questo microambiente ricostituito ha numerose potenziali applicazioni, tra cui test farmacologici, studi meccanicistici fondamentali e modellazione delle malattie. Il microambiente ricostruito ha un potenziale significativo per un'ampia gamma di applicazioni, come i test antidroga 23,40,41 e la modellazione delle malattie 12,13,14,30, nonché indagini meccanicistiche fondamentali sulla morfogenesi intestinale 42. Una varietà di saggi può essere eseguita raccogliendo surnatanti per la valutazione dei metaboliti 43, raccogliendo cellule per l'esame genomico 2,32 o esaminando visivamente le cellule utilizzando coloranti per cellule vive o fissazione per la successiva imaging a immunofluorescenza 23,44.
Questo studio presenta un protocollo riproducibile per lo sviluppo della morfogenesi 3D degli strati epiteliali intestinali canini in una piattaforma Gut-on-a-Chip. La struttura epiteliale 3D risultante fornisce una rappresentazione più realistica del microambiente intestinale, che ha un immenso potenziale per le applicazioni in vari studi biomedici. Utilizzando questa architettura intestinale, possiamo condurre più ricerche traslazionali e potenzialmente produrre risultati promettenti.

La morfogenesi dell'epitelio intestinale è stata ampiamente studiata attraverso modelli animali da laboratorio, che sono costosi, richiedono tempo e non rappresentano accuratamente i processi di sviluppo umano1. Inoltre, i modelli statici convenzionali di coltura cellulare 2D non sono in grado di imitare la complessa organizzazione spaziale di un'architettura epiteliale 3D2. Di conseguenza, è necessario un protocollo per indurre la morfogenesi 3D in vitro utilizzando cellule epiteliali intestinali provenienti da modelli animali rilevanti per l'uomo per far progredire la nostra comprensione dell'architettura epiteliale intestinale.
I cani da compagnia hanno sviluppato un'anatomia intestinale e una composizione del microbioma che sono notevolmente simili agli esseri umani a causa del loro ambiente condiviso e della dieta durante l'addomesticamento3. Oltre a questa somiglianza, sia gli esseri umani che i cani condividono varie morbilità croniche che si pensa siano attribuite alla salute intestinale. I cani, come gli esseri umani, possono sviluppare spontaneamente condizioni croniche come obesità, disfunzione cognitiva, diabete mellito, malattia infiammatoria intestinale (IBD) e adenocarcinoma colorettale 4,5,6,7,8,9,10. Nonostante lo sviluppo e l'uso di cellule epiteliali umane e murine in precedenti studi Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, l'epitelio intestinale canino non è stato utilizzato fino ad ora. Il nostro nuovo approccio, che utilizza l'epitelio organoide intestinale canino in un sistema di coltura dinamico con una morfogenesi epiteliale 3D, ha implicazioni significative sia per la medicina canina che per quella umana.
I recenti progressi nella coltura di organoidi intestinali hanno portato alla creazione di una coltura di organoidi intestinalicanini 15. Questo sistema di coltura prevede la coltura di cellule staminali intestinali sotto condizionamento morfogeno definito, ottenendo un modello 3D con proprietà auto-rinnovanti derivate da cellule staminali adulte16. Tuttavia, l'esecuzione di saggi di trasporto o cocolture ospite-microbioma pone difficoltà con questo modello 3D a causa della natura chiusa del lume intestinale17. Per risolvere questo problema, i ricercatori hanno generato un monostrato 2D derivato da organoidi intestinali, che consente l'esposizione della superficie luminale18,19. Tuttavia, sia gli organoidi 3D che i monostrati 2D sono mantenuti in condizioni statiche, che non riflettono accuratamente la biomeccanica in vivo del microambiente intestinale. La combinazione della tecnologia degli organoidi canini derivati dal paziente con la morfogenesi 3D in vitro rappresenta un'opportunità per la ricerca traslazionale sulle malattie croniche multifattoriali. Questo approccio consente ai ricercatori di sviluppare trattamenti più efficaci a beneficio sia degli esseri umani che dei cani e di far progredire ulteriormente la ricerca traslazionale, in linea con l'iniziativa One Health, che è un approccio collaborativo che riconosce l'interconnessione della salute umana, animale e ambientale. Promuove la cooperazione interdisciplinare per affrontare le complesse sfide sanitarie e ottenere risultati sanitari ottimali per tutti. Comprendendo le interdipendenze tra esseri umani, animali ed ecosistemi, l'iniziativa mira a mitigare i rischi derivanti da malattie infettive emergenti, degrado ambientale e altri problemi di salute condivisi20,21,22.
Questo protocollo delinea metodi completi per la coltura di cellule epiteliali intestinali canine ottenute da organoidi di pazienti su un microdispositivo Gut-on-a-Chip con una membrana porosa a base di polidimetilsilossano (PDMS). Stabilire la morfogenesi epiteliale 3D integrando organoidi intestinali canini e questa tecnologia Gut-on-a-Chip ci consente di studiare come l'intestino sviluppa e mantiene la sua organizzazione cellulare e la nicchia delle cellule staminali. Questa piattaforma offre una preziosa opportunità per studiare l'impatto delle comunità di microbioma sulla salute dell'intestino e capire come queste comunità generano metaboliti microbici che contribuiscono alla fisiopatologia intestinale14,23. Questi progressi possono ora essere estesi ai campioni intestinali canini, offrendo ai ricercatori l'opportunità di esplorare l'intricata relazione tra il microbioma intestinale e la fisiologia dell'ospite. Ciò apre la strada per ottenere preziose informazioni sui meccanismi alla base della fisiopatologia intestinale e comprendere il potenziale ruolo dei metaboliti microbici sia nella salute canina che in quella umana, nonché in varie condizioni patologiche. Il protocollo utilizzato per il Gut-on-a-Chip canino è riproducibile, il che lo rende un modello sperimentale adatto per la medicina comparata, in quanto questo approccio consente di studiare le interazioni ospite-microbioma, le infezioni da agenti patogeni e gli effetti terapeutici a base di probiotici sia nei cani che negli esseri umani.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

L'intestino canino possiede somiglianze in anatomia, microbiologia e fisiologia con quelli degli esseri umani e i cani sviluppano naturalmente disturbi intestinali spontanei simili agli esseri umani. Il superamento della limitazione intrinseca degli organoidi tridimensionali (3D) nell'accesso alla superficie apicale dell'epitelio intestinale ha portato alla generazione di colture monostrato bidimensionali (2D), che espongono la superficie luminale accessibile utilizzando cellule derivate dagli organoidi. L'integrazione di questi organoidi e di colture monostrato derivate da organoidi in un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip ha ulteriormente evoluto la tecnologia, consentendo lo sviluppo di modelli intestinali dinamici in vitro fisiologicamente più rilevanti.
In questo studio, presentiamo un protocollo per la generazione di morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale canino utilizzando campioni di tessuto intestinale primario ottenuti da cani affetti da malattie infiammatorie intestinali (IBD). Descriviamo anche un protocollo per la generazione e il mantenimento di colture monostrato 2D e sistemi intestine-on-a-chip utilizzando cellule derivate dagli organoidi intestinali 3D. I protocolli presentati in questo studio fungono da quadro di riferimento per la creazione di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip specificamente progettato per i cani. Gettando le basi per questo approccio innovativo, puntiamo ad ampliare l'applicazione di queste tecniche nella ricerca biomedica e traslazionale, allineandoci ai principi della One Health Initiative. Utilizzando questo approccio, possiamo sviluppare modelli dinamici in vitro più fisiologicamente rilevanti per lo studio della fisiologia intestinale sia nei cani che negli esseri umani. Ciò ha implicazioni significative per le applicazioni biomediche e farmaceutiche, in quanto può aiutare nello sviluppo di trattamenti più efficaci per le malattie intestinali in entrambe le specie.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

Autore in primo piano: Sviluppo e applicazione di un modello di intestino su chip IBD canino per studi di morfogenesi intestinale 3D 

Morfogenesi tridimensionale nell'intestino su chip canino utilizzando organoidi intestinali derivati da pazienti con malattie infiammatorie intestinali

Questo protocollo facilita in modo affidabile lo sviluppo spontaneo della morfogenesi intestinale 3D in un sistema Gut-on-a-Chip. Questo approccio utilizza cellule epiteliali intestinali canine ottenute da organoidi intestinali derivati da cani affetti da malattie infiammatorie intestinali (IBD) (Figura 1B). Raggruppamenti occasionali della morfogenesi 3D delle cellule epiteliali intestinali canine possono essere osservati in tutto il microcanale dopo 6-9 giorni di flusso medio (Figura 3C). Questi cambiamenti morfologici possono essere monitorati utilizzando tecniche di contrasto di fase. In questo studio, abbiamo utilizzato organoidi derivati da due cani con diagnosi di IBD. In particolare, la morfogenesi 3D di successo è stata osservata in due repliche biologiche, ciascuna delle quali è stata eseguita con due repliche tecniche. I risultati di questo studio forniscono una base per future indagini che coinvolgono organoidi intestinali derivati da altri donatori canini. Questi risultati dimostrano la potenziale applicabilità e ripetibilità del nostro approccio sperimentale, che è stato precedentemente riportato in campioni umani. Questi risultati forniscono un'ulteriore conferma che la tecnologia Gut-on-a-Chip è applicabile alle cellule epiteliali intestinali canine, come precedentemente riportato con gli studi che utilizzano cellule epiteliali intestinali umane2.
Questo protocollo ha dimostrato che la colorazione a immunofluorescenza può essere utilizzata per valutare la struttura 3D di monostrati derivati da organoidi che hanno formato strutture simili a villi in chip microfluidici utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale (Figura 4 A,B). Questo protocollo può essere adattato per validare i fenotipi cellulari differenziati e spazialmente organizzati attraverso la colorazione in immunofluorescenza. La visualizzazione di una morfogenesi 3D all'interno di un Gut-on-a-Chip fornisce un'eccellente opportunità per studiare la risposta dell'ospite durante varie interazioni patologiche 14,23,31. Se combinata con cellule epiteliali derivate da donatori pazienti, come precedentemente descritto nell'uomo, questa tecnologia può essere utilizzata per costruire modelli personalizzati di malattie intestinali13. Attraverso l'integrazione dell'imaging in immunofluorescenza con tecniche di visualizzazione mirata dell'RNA come l'ibridazione fluorescente in situ, può essere possibile analizzare visivamente i trascrittomi e i proteomi dell'ospite all'interno di un sistema Gut-on-a-Chip.
Preservare l'integrità della membrana intestinale è fondamentale per mantenere l'omeostasi intestinale e la piattaforma Gut-on-a-Chip offre un prezioso vantaggio consentendo un monitoraggio e una quantificazione precisi di questa funzione cruciale. La misurazione del TEER con la tecnologia Gut-on-a-Chip offre diversi vantaggi. Ad esempio, studi precedenti hanno valutato con successo il TEER durante la co-coltura di cellule intestinali con batteri non patogeni e probiotici32, nonché in condizioni di permeabilità intestinale23. Ciò consente ai ricercatori di studiare l'impatto di diverse condizioni sulla funzione di barriera intestinale e di identificare potenziali interventi per promuovere la salute intestinale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> Figura 1: Creazione di IBD canine Gut-on-a-Chip derivate dal paziente. (A) Integrazione degli organoidi intestinali derivati dal paziente e della piattaforma Gut-on-a-Chip. La biopsia endoscopica può essere eseguita per isolare le cellule della cripta intestinale per sviluppare organoidi intestinali specifici per il donatore. Le cellule epiteliali possono essere dissociate in singole cellule dagli organoidi, quindi seminate in un Gut-on-a-Chip basato su PDMS e coltivate in un microambiente dinamico unico. (B) Immagini rappresentative di colonoidi di un cane IBD. Barra di scala = 100 μm. (C) Questo schema illustra un dispositivo Gut-on-a-Chip costituito da una membrana porosa posta tra i microcanali superiore e inferiore. Il microcanale superiore è indicato dall'area blu, mentre il microcanale inferiore è indicato dall'area rossa. Su ciascun lato del microcanale sono presenti camere a vuoto, che deformano la membrana porosa per imitare il movimento peristaltico24. (D) Una configurazione di Gut-on-a-Chip canino include un Gut-on-a-Chip basato su PDMS assemblato con un tubo posizionato su un vetrino coprioggetto 2,24. Il tubo di bypass è fondamentale per evitare l'accumulo di pressione all'interno del microcanale durante la manipolazione (ad esempio, il collegamento alle siringhe). Le clip di legante vengono utilizzate per bloccare il tubo. I materiali sensibili al volume possono essere infusi attraverso i fori aperti dell'uscita superiore o inferiore. Il terreno di coltura organoide può essere infuso collegando le siringhe agli aghi con estremità smussata e il flusso attraverso l'ingresso superiore e inferiore. Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; PDMS = polidimetilsilossano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> Figura 2: Formazione di strutture simili a villi in IBD canine Gut-on-a-Chip. Le cellule epiteliali dissociate sono state seminate in un Gut-on-a-Chip rivestito di ECM. Una volta che le cellule dissociate sono state attaccate alla membrana PDMS, il flusso apicale è stato avviato per 3 giorni (D0-D3). Quando si forma un monostrato 2D confluente (D3), viene avviato un flusso basolaterale con allungamento frequente (Stretching, AP e BL Flow). Dopo 2-3 giorni di doppio flusso e allungamento della membrana, il monostrato 2D inizia a sviluppare la morfogenesi 3D e dopo 9 giorni di coltura si formano strutture simili a villi (morfogenesi 3D, D9-D12). Abbreviazioni: ECM = matrice extracellulare; PDMS = polidimetilsilossano; AP = apicale; BL = basolaterale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> Figura 3: Semina di organoidi intestinali canini e morfogenesi 3D in un Gut-on-a-Chip. (A) Le fasi sperimentali per l'attivazione superficiale di una membrana porosa in un Gut-on-a-Chip basato su PDMS. L'utilizzo del trattamento UV/Ozono, PEI e trattamento GA in combinazione facilita la reticolazione delle ammine presenti nelle soluzioni ECM. Questo processo porta all'immobilizzazione stabile delle proteine ECM sulla membrana porosa. (B) Le immagini a contrasto di fase mostrano le morfologie delle cellule immediatamente dopo la semina (a sinistra) e 3-5 ore dopo la semina (a destra). La membrana porosa dopo 3 ore di semina mostra aree più sottili e più scure in cui le singole cellule si sono attaccate, evidenziando il processo di attaccamento. (C) Le immagini a contrasto di fase raffigurano la morfogenesi 3D dei monostrati intestinali all'interno di un sistema Gut-on-a-Chip. Questi monostrati sono stati derivati da cani affetti da IBD e queste cellule organoidi sono state coltivate per un periodo di 12 giorni in condizioni dinamiche, che hanno comportato il flusso di fluidi e movimenti di allungamento. Barre di scala = 50 μm (B,C). Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; ECM = matrice extracellulare; PDMS = polidimetilsilossano; PEI = polietilimmina; GA = glutaraldeide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione dello sviluppo morfologico 3D in Gut-on-a-Chip canino derivato da pazienti. (A) Imaging a immunofluorescenza di un Gut-on-a-Chip IBD canino, che mostra una vista dall'alto verso il basso di un epitelio 3D completamente sviluppato dopo 12 giorni di coltura, che viene valutato da un microscopio a fluorescenza. La proteina della giunzione stretta (ZO-1) è visualizzata in giallo; la membrana del bordo del pennello (F-actina) appare in rosso; e i nuclei sono colorati con DAPI e appaiono blu. (B) Imaging a immunofluorescenza di un Gut-on-a-Chip IBD canino utilizzando un microscopio confocale con una lente a lunga distanza. Come mostrato nello schema, viene mostrata un'immagine fluorescente di una sezione trasversale di una struttura simile a un villo di un epitelio 3D completamente sviluppato dopo 12 giorni di coltura. Inoltre, l'impilamento Z mostra una vista laterale dell'epitelio 3D, che rivela la formazione di strutture simili a villoni. La membrana del bordo a spazzola (F-actina) appare in rosso e i nuclei sono colorati con DAPI e appaiono blu. (C) La funzione di barriera intestinale è stata valutata e misurata mediante TEER in Gut-on-a-Chips canini derivati da pazienti. Valori stabili di TEER sono stati raggiunti il giorno 5 di coltura su Gut-on-a-Chip. Le barre di errore esprimono il SEM delle misurazioni. Il valore di TEER è stato misurato tra due repliche biologiche con una replica tecnica. Barre di scala = 50 μm (A), 25 μm (B). Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TEER = resistenza elettrica transepiteliale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare S1: Caratterizzazione dell'anticorpo policlonale anti-ZO-1 in monostrati derivati da colonoidi canini e su dispositivi Gut-on-a-Chip. (A) Colorazione in immunofluorescenza di ZO-1 in giallo con F-actina in rosso e loro immagine di sovrapposizione. Barra della scala = 25 μm. (B) La visualizzazione in immunofluorescenza di ZO-1 in giallo in "Leaky Gut Chips" è stata condotta in varie condizioni, tra cui la stimolazione con batteri probiotici (LGG + citochine o VSL#3 + citochine) e controlli privi di germi senza stimolazione probiotica (citochine). Barra graduata = 50 μm. Questa figura è riprodotta da Min et al.23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare S1: Sintesi delle informazioni sui donatori di tessuti. Una tabella riassuntiva dell'età, del sesso, della razza, della valutazione istopatologica e del punteggio dell'indice di attività IBD canina (CIBDAI) dei donatori. Il CIBDAI è un sistema di punteggio numerico utilizzato per dedurre la gravità clinica nell'IBD33 canina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Application of a Canine IBD Gut-on-a-Chip Model for 3D Intestinal Morphogenesis Studies at JoVE.com

L'integrazione di organoidi intestinali canini e di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip offre modelli traslazionali rilevanti per le malattie intestinali umane. I protocolli presentati consentono la morfogenesi 3D e la modellazione dinamica in vitro dell'intestino, aiutando nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie intestinali nei cani e negli esseri umani con One Health.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

Il nostro obiettivo di ricerca è quello di creare un metodo per la crescita di strutture 3D utilizzando cellule intestinali di animali simili all'uomo, in particolare cani. La morfogenesi cellulare intestinale è stata ampiamente studiata attraverso modelli animali da laboratorio, che sono costosi, richiedono tempo e non rappresentano accuratamente i processi di sviluppo umano. Inoltre, i modelli statici convenzionali di coltura cellulare 2D non sono in grado di imitare la complessa organizzazione spaziale di un'architettura 3D abSerial.Ottenere l'adesione di singole cellule derivate da organoidi intestinali sulla superficie PDMS rivestita di ECM ha rappresentato una sfida significativa. Un passo fondamentale nell'affrontare questa sfida, sia per garantire un rivestimento ECM uniforme attraverso l'attivazione superficiale che per consentirne l'asciugatura durante la notte. L'integrazione della tecnologia degli organoidi canini derivati dal paziente con la morfogenesi 3D in vitro offre una strada promettente per condurre ricerche traslazionali sulle malattie croniche multifattoriali, in linea con l'iniziativa One Health.Il protocollo per l'IBD canina, ottenuto su un chip, offre un modello replicabile per la medicina comparata, consentendo studi sulla morfogenesi intestinale, sulle interazioni ospite-microbioma, sulle infezioni, sugli screening di farmaci e probiotici e ha un'applicabilità interspecie.

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K Views.  Washington State University. Il nostro obiettivo di ricerca è quello di creare un metodo per la crescita di strutture 3D utilizzando cellule intestinali di animali simili all'uomo, in particolare cani. La morfogenesi cellulare intestinale è stata ampiamente studiata attraverso modelli animali da laboratorio, che sono costosi, richiedono tempo e non rappresentano accuratamente i processi di sviluppo umano. Inoltre, i modelli statici convenzionali di coltura cellulare 2D non sono in grado di imitare la complessa organizz...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo e applicazione di un modello di intestino su chip IBD canino per studi di morfogenesi intestinale 3D 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.