Questo lavoro è stato sostenuto da NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Dipartimento della Difesa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green e Hongli Wu)

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dell'Associazione per la ricerca sulla visione e l'oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. L'approvazione procedurale è stata concessa dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas settentrionale Health Science Center (numero di protocollo: IACUC-2022-0008). In questi studi sono stati utilizzati topi giovani C57BL/6J, in genere di età inferiore alle 2 settimane.
1. Preparazione del terreno di coltura e dissezione delle lenti
<ol><li>Preparare il terreno di coltura aggiungendo 50 mL di siero fetale bovino (FBS) e 0,1 mL di gentamicina 50 mg/mL a 450 mL di DMEM.</li>
	<li>Sopprimere umanamente i topi C57BL/6J di età inferiore a 2 settimane. NOTA: Abbiamo praticato l'eutanasia utilizzando il metodo di inalazione di CO2 . Una portata ottimale per i sistemi di eutanasia di CO2 dovrebbe spostare dal 30% al 70% del volume della camera o della gabbia/min.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente le palpebre con le forbici chirurgiche e applicare una leggera pressione con una pinzetta curva sui lati opposti dell'orbita, facendo sporgere l'occhio verso l'esterno. Praticare un'accurata incisione sulla cornea utilizzando il coltello per cataratta ed estrarre con cautela la lente utilizzando una pinzetta curva, assicurandosi di non danneggiare la lente o la sua capsula. NOTA: Prestare attenzione durante l'esecuzione di questi passaggi per mantenere l'integrità della capsula dell'obiettivo. A causa della natura delicata della lente, è importante utilizzare strumenti di dissezione con punte curve e smussate per ridurre al minimo il rischio di danni alla lente.</li>
	<li>Utilizzare pinzette curve con punte smussate per trasferire le lenti in un piatto di coltura di tessuti in plastica da 60 mm riempito con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco preriscaldata e sterile contenente 10 μg/mL di gentamicina.</li>
	<li>Sciacquare delicatamente le lenti con una soluzione DPBS contenente 10 μg/mL di gentamicina per rimuovere eventuali detriti o contaminanti, preparare le lenti per un'ulteriore lavorazione e mantenere un ambiente di coltura sterile.</li>
	<li>Per ottenere un numero adeguato di LEC, raggruppare quattro lenti per una piastra di coltura a 24 pozzetti e sei lenti per una piastra di coltura a 6 pozzetti.</li>
</ol>2. Isolamento dei LEC
<ol><li>Dopo aver completato il processo di risciacquo, posizionare l'obiettivo su un pezzo di carta da filtro, lasciandolo asciugare.</li>
	<li>Una volta che la lente è sufficientemente asciutta, trasferirla con cura sul coperchio di una capsula di Petri in preparazione per la rimozione della capsula della lente.</li>
	<li>Ruotare la lente verso l'alto, assicurandosi che il segmento anteriore sia rivolto verso l'alto. Mentre usi le pinzette per tenere la capsula anteriore, impiega la pinza per capsuloressi nella mano dominante per creare una piccola lacerazione nella capsula. Tirare delicatamente i due strumenti in direzioni opposte per rimuovere la capsula e metterla in DPBS fino al completamento di tutte le dissezioni della lente. NOTA: Per evitare discrepanze, i ricercatori devono sezionare prontamente ciascuna capsula epiteliale del cristallino e conservarla temporaneamente in DPBS. Solo dopo aver completato tutte le dissezioni, le capsule vengono trasferite collettivamente alla tripsina mantenuta a 37 °C, garantendo un'esposizione sincronizzata e uniforme.</li>
	<li>Trasferire con cautela la capsula dell'obiettivo su una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% in ciascun pozzetto per avviare il processo di digestione enzimatica.</li>
	<li>Agitare delicatamente la soluzione di tripsina per garantire una permeazione uniforme. Mettere la piastra in un incubatore per colture cellulari e lasciare digerire la capsula per 8-10 minuti a 37 °C. NOTA: Questo passaggio facilita la disgregazione del tessuto della capsula del cristallino e il successivo rilascio delle singole cellule epiteliali.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, tritare con cura la capsula del cristallino digerita usando le forbici da dissezione per abbattere eventuali grumi di tessuto rimanenti e promuovere la separazione cellulare. NOTA: L'accuratezza nella triturazione dei tessuti è enfatizzata per garantire un efficiente rilascio cellulare dalle capsule di lenti digerite.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL del terreno di coltura contenente il 10% di FBS per estinguere la tripsina. Trasferire i campioni di tessuto in una provetta di centrifugazione e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Utilizzare 1 mL di terreno di coltura per risospendere le cellule e seminare le cellule in una piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.</li>
</ol>3. Sottocultura LEC
<ol><li>Una volta che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il terreno dalla piastra di coltura. Procedere al lavaggio delle cellule 2 volte con 1 mL di DPBS.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice e ispezionarle al microscopio per confermare che si siano staccate dalla piastra di coltura e abbiano iniziato a galleggiare.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura e pipettare delicatamente le cellule 3-5 volte per staccare tutte le cellule.</li>
	<li>Trasferire le cellule in provette da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di coltura completo.</li>
	<li>Se necessario, contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Suddividere la sospensione cellulare in un rapporto 1:2 o 1:3 a scopo di subcoltura.</li>
	<li>Quando la cultura diventa di nuovo confluente, ripetere le procedure sopra descritte. NOTA: I LEC prosperano in condizioni di coltura ad alta densità. Evitare di diluire eccessivamente le cellule, in quanto ciò potrebbe ostacolarne la crescita.</li>
</ol>4. Stoccaggio e spedizione
NOTA: Il numero di celle ideale per la conservazione è ~1 × 106.
<ol><li>Lavare accuratamente le celle 3 volte con 1 mL di DPBS. Dopo il lavaggio, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA e mettere le cellule nell'incubatore per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare nella provetta da centrifuga e centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un terreno di congelamento composto per il 90% da FBS e per il 10% da DMSO, con l'obiettivo di ottenere una densità cellulare di 1 × 106 cellule/mL. Trasferire la sospensione cellulare nel crioviale.</li>
	<li>Spostare immediatamente le celle in un ambiente a -20 °C per 1 ora, seguito da -80 °C durante la notte, prima della conservazione permanente in azoto liquido. NOTA: Se l'azoto liquido non è disponibile, le celle possono essere conservate a -80 °C dopo un'ora iniziale a -20 °C.</li>
	<li>Se è necessaria una spedizione, spedire le cellule nel crioviale in un pacco con ghiaccio secco per la consegna durante la notte.</li>
	<li>Al ricevimento delle cellule, garantire un rapido recupero e posizionare le cellule nella sottocoltura. Se la coltura immediata non è fattibile, trasferire le cellule in azoto liquido per una conservazione prolungata. NOTA: Se le cellule devono essere spedite, assicurarsi che i campioni siano profondamente sepolti nel ghiaccio secco per evitare potenziali danni dovuti a fluttuazioni di temperatura.</li>
</ol>5. Convalida LEC
<ol><li>Placcare i LEC in piastre di coltura da 35 mm con bicchieri di copertura e coltivarli per circa 48 ore.</li>
	<li>Lavare le celle 2 volte con PBS e fissare le celle con metanolo freddo per 10 minuti a -20 °C.</li>
	<li>Lavare le cellule fisse per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule fisse con tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente per evitare legami non specifici.</li>
	<li>Dopo il blocco, incubare le cellule per una notte a 4 °C con gli anticorpi primari (αA-cristallina, γ-cristallina e anticorpi PROX1) diluiti singolarmente in un rapporto 1:50 in tampone diluente.</li>
	<li>Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e incubare le cellule con l'anticorpo secondario diluito 1:100 in tampone diluente per 1 ora.</li>
	<li>Lavare le cellule per 3 x 5 minuti con PBS e colorare le cellule con 5 μg/mL di Hoechst 33342 in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente per visualizzare i nuclei.</li>
	<li>Lavare le cellule per 2 x 5 minuti con PBS per rimuovere la soluzione colorante in eccesso e acquisire immagini fluorescenti delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il canale DAPI per i nuclei e il canale FITC per αA-, γ-cristalline e PROX1.</li>
</ol>

Coltivazione e caratterizzazione delle cellule epiteliali del cristallino

<ol>
	<li>Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).</li><li>Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallins+and+their+synthesis+in+human+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.">Crystallins and their synthesis in human lens epithelial cells in tissue culture.</a> Experimental Eye Research. 47 (3), 465-478 (1988).</li><li>Lee, C. M., Afshari, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+state+of+cataract+blindness.">The global state of cataract blindness.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 28 (1), 98-103 (2017).</li><li>Khairallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+people+blind+or+visually+impaired+by+cataract+worldwide+and+in+world+regions,+1990+to+2010.">Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).</li><li>Beebe, D. C., Holekamp, N. M., Shui, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+and+the+prevention+of+age-related+cataracts.">Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts.</a> Ophthalmic Research. 44 (3), 155-165 (2010).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+in+the+lens.">Redox regulation in the lens.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (5), 657-682 (2003).</li><li>Charakidas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+epithelial+apoptosis+and+cell+proliferation+in+human+age-related+cortical+cataract.">Lens epithelial apoptosis and cell proliferation in human age-related cortical cataract.</a> European Journal of Ophthalmology. 15 (2), 213-220 (2005).</li><li>Lou, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutaredoxin+in+redox+regulation+and+cell+signaling+of+the+lens.">Glutathione and glutaredoxin in redox regulation and cell signaling of the lens.</a> Antioxidants (Basel). 11 (10), 1973 (2022).</li><li>Wilhelm, J., Smistik, Z., Mahelkova, G., Vytasek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+proliferation+of+lens+epithelial+cells+in+culture.">Redox regulation of proliferation of lens epithelial cells in culture.</a> Cell Biochemistry &amp; Function. 25 (3), 317-321 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+concerning+a+novel+intraocular+lens+for+the+prevention+of+posterior+capsular+opacification.">Research progress concerning a novel intraocular lens for the prevention of posterior capsular opacification.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1343 (2022).</li><li>Konopinska, J., Mlynarczyk, M., Dmuchowska, D. A., Obuchowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posterior+capsule+opacification:+A+review+of+experimental+studies.">Posterior capsule opacification: A review of experimental studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (13), 2847 (2021).</li><li>Pandey, S. K., Apple, D. J., Werner, L., Maloof, A. J., Milverton, E. 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G., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture--iv.+Some+characteristics+of+the+process,+including+possible+in+vitro+models+for+pathogenic+processes+in+cataractogenesis.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture--iv. Some characteristics of the process, including possible in vitro models for pathogenic processes in cataractogenesis.</a> Vision Research. 21 (1), 25-35 (1981).</li><li>Creighton, M. O., Mousa, G. Y., Trevithick, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+lens+epithelial+cells+in+tissue+culture.+(i)+effects+of+cell+density,+medium+and+embryonic+age+of+initial+culture.">Differentiation of rat lens epithelial cells in tissue culture. (i) effects of cell density, medium and embryonic age of initial culture.</a> Differentiation. 6 (3), 155-167 (1976).</li><li>Ibaraki, N., Ohara, K., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+lens+epithelial+cells+from+senile+cataract+patients.">Explant culture of human lens epithelial cells from senile cataract patients.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 37 (3), 310-317 (1993).</li><li>Sundelin, K., Petersen, A., Soltanpour, Y., Zetterberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+lens+epithelial+cells+from+cataract+patients+-+association+with+possible+risk+factors+for+posterior+capsule+opacification.">In vitro growth of lens epithelial cells from cataract patients - association with possible risk factors for posterior capsule opacification.</a> The Open Ophthalmology Journal. 8, 19-23 (2014).</li><li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells.">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178 (2022).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+proliferative+studies+on+ex+vivo+cultured+human+anterior+lens+epithelial+cells+-+relevance+to+capsular+opacification.">Morphological and proliferative studies on ex vivo cultured human anterior lens epithelial cells - relevance to capsular opacification.</a> Acta Ophthalmologica. 93 (6), e499-e506 (2015).</li><li>Andjelic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+establishing+adherent+ex+vivo+explant+cultures+from+human+eye+pathologies+for+use+in+subsequent+calcium+imaging+and+inflammatory+studies.">A simple method for establishing adherent ex vivo explant cultures from human eye pathologies for use in subsequent calcium imaging and inflammatory studies.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 232659 (2014).</li><li>Andley, U. P., Rhim, J. S., Chylack, L. T., Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+immortalization+of+human+lens+epithelial+cells+in+culture.">Propagation and immortalization of human lens epithelial cells in culture.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 35 (7), 3094-3102 (1994).</li><li>Zhou, M., Leiberman, J., Xu, J., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+proliferative+cells+exists+in+mouse+lens+epithelium:+Implications+for+lens+maintenance.">A hierarchy of proliferative cells exists in mouse lens epithelium: Implications for lens maintenance.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 47 (7), 2997-3003 (2006).</li><li>Wolffe, A. P., Glover, J. F., Tata, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+shock.+Synthesis+of+heat-shock-like+proteins+in+fresh+primary+cell+cultures.">Culture shock. Synthesis of heat-shock-like proteins in fresh primary cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 154 (2), 581-590 (1984).</li><li>Haykin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioimage+analysis+of+cell+physiology+of+primary+lens+epithelial+cells+from+diabetic+and+non-diabetic+cataract+patients.">Bioimage analysis of cell physiology of primary lens epithelial cells from diabetic and non-diabetic cataract patients.</a> Biotechnology &amp; Biotechnological Equipment. 35 (1), 170-178 (2021).</li><li>Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+embryo+lens+cultures+mimic+differentiation+in+the+lens.">Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens.</a> Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).</li><li>Zelenka, P. S., Gao, C. Y., Saravanamuthu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+rat+lens+epithelial+explants+for+studying+terminal+differentiation.">Preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1591 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il protocollo presentato in questo documento fornisce una guida completa e dettagliata per il successo dell'isolamento, della cultura e della sottocultura dei LEC primari, completa di documentazione video di accompagnamento. La guida visiva dettagliata, insieme alle istruzioni scritte, migliora la chiarezza e l'accessibilità del protocollo, promuovendone l'uso e la riproducibilità tra i ricercatori del settore. L'obiettivo finale è quello di contribuire all'espansione delle conoscenze che circondano il ruolo dei LEC n...

Il cristallino dell'occhio svolge un ruolo cruciale nella visione focalizzando la luce in entrata sulla retina. È costituito da una struttura trasparente e avascolare composta da cellule specializzate, tra le quali le cellule epiteliali del cristallino (LEC) sono protagoniste. I LEC si trovano sulla superficie anteriore del cristallino e sono responsabili del mantenimento della sua trasparenza, della regolazione dell'equilibrio idrico e della partecipazione alla crescita e allo sviluppo del cristallino 1,2. I LEC sono un tipo unico di cellule situate nella parte anteriore del cristallino, che svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della chiarezza e della funzione del cristallino producendo continuamente fibre del cristallino per tutta la vita.
La cataratta è caratterizzata dal progressivo offuscamento del cristallino, con conseguente distorsione e dispersione della luce, che porta a una visione compromessa 3,4. I meccanismi precisi alla base della formazione della cataratta sono complessi e multifattoriali, coinvolgendo vari processi cellulari e molecolari come la radiazione UV, il danno ossidativo e la glicazione 5,6. È stato riscontrato che i LEC contribuiscono in modo significativo allo sviluppo della cataratta, rendendoli un obiettivo vitale della ricerca 1,2,7,8,9.
Inoltre, uno dei problemi più urgenti in oftalmologia oggi è l'incidenza relativamente elevata di opacizzazione della capsula posteriore (PCO), nota anche come cataratta secondaria. La PCO rimane la complicanza più comune dopo l'intervento di cataratta, colpendo fino al 20-40% dei pazienti adulti e il 100% dei bambini entro 5 anni dall'intervento chirurgico10. La PCO è causata principalmente dai LEC residui che rimangono nel sacco capsulare dopo l'estrazione della cataratta. Queste cellule subiscono una trasformazione fisiopatologica multiforme che coinvolge non solo la transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT), ma anche la differenziazione dei LEC in fibre del cristallino, risultando in una popolazione cellulare che è una miscela di LEC, fibre e miofibroblasti 11,12,13. Le cellule trasformate proliferano e migrano attraverso la capsula posteriore del cristallino, portando a una compromissione della vista. La comprensione del comportamento e dei meccanismi di controllo dei LEC nei modelli di coltura può fornire preziose informazioni sulla prevenzione e la gestione della PCO. Pertanto, questo protocollo di coltura dei LEC rappresenta uno strumento vitale per i ricercatori oftalmici che mirano a studiare, comprendere e, infine, combattere questa complicanza postoperatoria prevalente.
Per svelare le complessità della biologia LEC e il suo ruolo nella formazione della cataratta e della PCO, è essenziale stabilire sistemi di coltura cellulare primaria in vitro robusti e riproducibili. La coltura primaria di LEC fornisce ai ricercatori un ambiente controllato per studiare le funzioni, la segnalazione e le caratteristiche molecolari dei LEC. Inoltre, consente di studiare i processi cellulari e gli effetti di diverse condizioni sperimentali, fornendo preziose informazioni sulla fisiologia e sulla patologia del cristallino.
Ricerche precedenti hanno arricchito la nostra comprensione delle tecniche di coltura LEC 14,15,16,17,18,19,20. Sebbene questi studi abbiano impiegato varie metodologie e prodotto risultati significativi sul comportamento e sulle caratteristiche dei LEC, un protocollo di registrazione video completo e accessibile per la coltura dei LEC è assente nella letteratura attuale. Questa limitazione può ostacolare la capacità dei ricercatori alle prime armi di riprodurre accuratamente le tecniche e può portare a incongruenze e variazioni nei risultati sperimentali. Fornendo un protocollo di registrazione video, questo documento di ricerca mira a colmare questa lacuna e a fornire una risorsa standardizzata in grado di migliorare la riproducibilità e facilitare il trasferimento di conoscenze nel campo della cultura LEC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#25300054</td>
			<td>For LECs dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary Antibody&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>#715-545-150</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-605-003</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaver safety knife</td>
			<td>Beaver-Visitec International</td>
			<td>#3782235</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>#927-60001</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsulorhexis forceps</td>
			<td>Titan Medical Instruments</td>
			<td>TMF-124</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>#D2650</td>
			<td>For making freezing medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#J67802</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-4976</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpiCGS-a (optional)</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>4182</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (50&#160;mg/mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397</td>
			<td>For LECs culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#62249</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS-5983</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument&#160;</td>
			<td>RS5137&#160;</td>
			<td>For lens dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROX1 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11067-2-AP</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas micro-dissecting spring scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5608</td>
			<td>For lens capsule isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;A-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-28306</td>
			<td>For cell validation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-crystallin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-365256</td>
			<td>For cell validation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing mouse primary lens epithelial cell culture: a comprehensive guide to trypsinization

Le cellule epiteliali del cristallino (LEC) svolgono molteplici ruoli importanti nel mantenimento dell'omeostasi e della normale funzione del cristallino. I LEC determinano la crescita, lo sviluppo, le dimensioni e la trasparenza delle lenti. Al contrario, i LEC disfunzionali possono portare alla formazione della cataratta e all'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Di conseguenza, la creazione di un solido sistema di coltura LEC primario è importante per i ricercatori impegnati nello sviluppo di lenti, nella biochimica, nelle terapie della cataratta e nella prevenzione della PCO. Tuttavia, la coltivazione di LEC primari ha presentato a lungo sfide a causa della loro disponibilità limitata, del lento tasso di proliferazione e della natura delicata. 
Questo studio affronta questi ostacoli presentando un protocollo completo per la coltura LEC primaria. Il protocollo comprende fasi essenziali come la formulazione di un terreno di coltura ottimizzato, l'isolamento preciso delle capsule di lenti, le tecniche di tripsinizzazione, le procedure di sottocoltura, i protocolli di raccolta e le linee guida per lo stoccaggio e la spedizione. Durante tutto il processo di coltura, la morfologia cellulare è stata monitorata utilizzando la microscopia a contrasto di fase. 
Per confermare l'autenticità dei LEC in coltura, sono stati condotti saggi di immunofluorescenza per rilevare la presenza e la distribuzione subcellulare di proteine lente critiche, vale a dire αA- e γ-cristalline. Questo protocollo dettagliato fornisce ai ricercatori una risorsa preziosa per coltivare e caratterizzare i LEC primari, consentendo progressi nella nostra comprensione della biologia del cristallino e nello sviluppo di strategie terapeutiche per i disturbi correlati al cristallino.

The lens of the eye plays a crucial role in vision by focusing incoming light onto the retina. It consists of a transparent, avascular structure composed of specialized cells, among which lens epithelial cells (LECs) are key players. LECs are located at the anterior surface of the lens and are responsible for maintaining its transparency, regulating water balance, and participating in lens growth and development1,2. LECs are a unique type of cells located at the anterior part of the lens, playing a critical role in maintaining lens clarity and function by continuously producing lens fibers throughout life.
Cataracts are characterized by the progressive clouding of the lens, resulting in the distortion and scattering of light, leading to compromised vision3,4. The precise mechanisms underlying cataract formation are complex and multifactorial, involving various cellular and molecular processes such as UV radiation, oxidative damage, and glycation5,6. LECs have been found to contribute significantly to the development of cataracts, making them a vital focus of research1,2,7,8,9.
Furthermore, one of the most pressing issues in ophthalmology today is the relatively high incidence of posterior capsule opacification (PCO), also known as secondary cataract. PCO remains the most common complication after cataract surgery, affecting up to 20-40% of adult patients and 100% of children within 5 years post surgery10. PCO is primarily caused by the residual LECs that remain in the capsular bag following cataract extraction. These cells undergo a multifaceted pathophysiological transformation involving not only epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) but also the differentiation of LECs to lens fibers, resulting in a cell population that is a mixture of LECs, fibers, and myofibroblasts11,12,13. The transformed cells proliferate and migrate across the posterior lens capsule, leading to visual impairment. Understanding the behavior and control mechanisms of LECs in culture models can provide valuable insights into the prevention and management of PCO. Therefore, this protocol of culturing LECs presents a vital tool for ophthalmic researchers aiming to study, understand, and ultimately combat this prevalent postoperative complication.
To unravel the intricacies of LEC biology and its role in cataract formation and PCO, it is essential to establish robust and reproducible in vitro primary cell culture systems. Primary LEC culture provides researchers with a controlled environment to study the functions, signaling, and molecular characteristics of LECs. Furthermore, it allows for the investigation of cellular processes and the effects of different experimental conditions, providing valuable insights into lens physiology and pathology.
Prior research has enriched our understanding of LEC culture techniques14,15,16,17,18,19,20. Although these studies have employed various methodologies and yielded significant findings on LEC behavior and characteristics, a comprehensive and accessible video recording protocol for culturing LECs is absent in the current literature. This limitation can hinder novice researchers&#39; ability to accurately reproduce the techniques and can lead to inconsistencies and variations in experimental results. By providing a video recording protocol, this research paper aims to bridge this gap and provide a standardized resource that can enhance reproducibility and facilitate knowledge transfer in the field of LEC culture.

Autore in primo piano: Svelare i segreti della cataratta - Indagine sugli enzimi di riparazione redox nelle cellule epiteliali del cristallino

Ottimizzazione della coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino di topo: una guida completa alla tripsinizzazione

Our research objective is to explore the underlying causes of cataracts with a particular emphasis on the function of redox repair enzymes. Our aim is to identify the critical role this enzyme play in lens protection, and to establish their potential as drug targets for cataract prevention and treatment. Among many exciting technologies, our research uses lens epithelial cells as a foundational platform.This approach is critical for unraveling the mechanism behind cataract formation, posterior capsule opacification, and the discovery of new anti-cataract drugs. Moving forward, we will focus on understanding the impact of antioxidant enzymes and aging on lens functionality. Our goal is to discover innovative antioxidant treatments that can delay lens aging, prevent cataracts, and provide effective intervention for PCO.

Come mostrato nella Figura 2, seguendo questo protocollo, i LEC primari dei topi C57BL/6J hanno aderito alle piastre entro un periodo di 4 ore. In particolare, c'erano resti visibili di altri tessuti come sezioni della capsula posteriore e cellule della fibra del cristallino. Tuttavia, questi elementi non intenzionali non si attaccavano al piatto e potevano, quindi, essere rimossi cambiando il terreno di coltura. Successivamente, tra il terzo e il quinto giorno, i LEC hanno iniziato la loro ...

Questo manoscritto delinea un protocollo video dettagliato per la coltura di cellule epiteliali primarie del cristallino (LEC), con l'obiettivo di migliorare la riproducibilità e aiutare la ricerca sulla cataratta e sull'opacizzazione della capsula posteriore (PCO). Offre istruzioni dettagliate sulla dissezione delle lenti, l'isolamento e la convalida dei LEC, fungendo da guida preziosa, soprattutto per i nuovi arrivati nel settore.

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, ...

Il nostro obiettivo di ricerca è quello di esplorare le cause alla base della cataratta con particolare enfasi sulla funzione degli enzimi di riparazione redox. Il nostro obiettivo è quello di identificare il ruolo critico che questo enzima svolge nella protezione del cristallino e di stabilire il suo potenziale come bersagli farmacologici per la prevenzione e il trattamento della cataratta. Tra le molte tecnologie interessanti, la nostra ricerca utilizza le cellule epiteliali del cristallino come piattaforma fondamentale.Questo approccio è fondamentale per svelare il meccanismo alla base della formazione della cataratta, dell'opacizzazione della capsula posteriore e della scoperta di nuovi farmaci anti-cataratta. In futuro, ci concentreremo sulla comprensione dell'impatto degli enzimi antiossidanti e dell'invecchiamento sulla funzionalità delle lenti. Il nostro obiettivo è scoprire trattamenti antiossidanti innovativi in grado di ritardare l'invecchiamento del cristallino, prevenire la cataratta e fornire un intervento efficace per la PCO.

optimizing-mouse-primary-lens-epithelial-cell-culture-comprehensive

Research

JoVE Journal

Biology

Optimizing Mouse Primary Lens Epithelial Cell Culture: A Comprehensive Guide to Trypsinization

1.1K Views.  University of North Texas Health Science Center. Il nostro obiettivo di ricerca è quello di esplorare le cause alla base della cataratta con particolare enfasi sulla funzione degli enzimi di riparazione redox. Il nostro obiettivo è quello di identificare il ruolo critico che questo enzima svolge nella protezione del cristallino e di stabilire il suo potenziale come bersagli farmacologici per la prevenzione e il trattamento della cataratta. Tra le molte tecnologie interessanti, la nostra ricerca utilizza le cellule epiteliali del cristalli...

Video: Autore in primo piano: Svelare i segreti della cataratta - Indagine sugli enzimi di riparazione redox nelle cellule epiteliali del cristallino

Lens epithelial cells (LECs) play multiple important roles in maintaining the homeostasis and normal function of the lens. LECs determine lens growth, development, size, and transparency. Conversely, dysfunctional LECs can lead to cataract formation and posterior capsule opacification (PCO). Consequently, establishing a robust primary LEC culture system is important to researchers engaged in lens development, biochemistry, cataract therapeutics, and PCO prevention. However, cultivating primary LECs has long presented challenges due to their limited availability, slow proliferation rate, and delicate nature. 
This study addresses these hurdles by presenting a comprehensive protocol for primary LEC culture. The protocol encompasses essential steps such as the formulation of an optimized culture medium, precise isolation of lens capsules, trypsinization techniques, subculture procedures, harvest protocols, and guidelines for storage and shipment. Throughout the culture process, cell morphology was monitored using phase-contrast microscopy. 
To confirm the authenticity of the cultured LECs, immunofluorescence assays were conducted to detect the presence and subcellular distribution of critical lens proteins, namely &#945;A- and &#947;-crystallins. This detailed protocol equips researchers with a valuable resource for cultivating and characterizing primary LECs, enabling advancements in our comprehension of lens biology and the development of therapeutic strategies for lens-related disorders.

This manuscript outlines a detailed video protocol for culturing primary lens epithelial cells (LECs), aiming to improve reproducibility and aid research in cataracts and posterior capsule opacification (PCO). It offers step-by-step instructions on lens dissection, LECs isolation, and validation, serving as a valuable guide, especially for newcomers in the field.