Gli autori ringraziano la dottoressa Karine Loulier per l'accesso alla linea di topi transgenici MAGIC-Markers. Gli autori ringraziano anche la struttura RAM-Neuro e la struttura di imaging MRI, un membro dell'infrastruttura nazionale France-BioImaging supportata dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-10-INBS-04, "Investimenti per il futuro"). Questa ricerca è stata sostenuta dal programma ATIP-Avenir, dall'Inserm, dalla Région Occitanie, dall'Università di Montpellier, dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR-21-CE17-0061), dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) e dalla Fondazione Groupama.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal National Animal Experiment Board.
1. Preparativi
<ol><li>Preparare una soluzione anestetica di ketamina-xilazina per l'anestesia. Iniettare ketamina a 80 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg diluendo 200 μL di ketamina (100 mg/mL) e 125 μL di xilazina (20 mg/mL) in 2.175 mL di NaCl sterile allo 0,9%.</li>
	<li>Preparare una soluzione 0,02 mg/mL di buprenorfina come soluzione analgesica aggiungendo 100 μL di buprenorfina 0,3 mg/mL a 1.400 mL di NaCl sterile allo 0,9%.</li>
	<li>Preparare la soluzione colorante fluorescente.<ol><li>Utilizzare una bilancia fine per pesare 10 mg di sale di fluoresceina e diluirlo in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere una soluzione di fluoresceina allo 0,1%.</li>
		<li>Proteggere la soluzione dalla luce e agitarla per 5 min. Utilizzare una siringa da 10 mL e un filtro per siringa da 0,2 μm per filtrare la soluzione. NOTA: La soluzione fluorescente deve essere protetta dalla luce e può essere conservata a +4 °C per 5 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del mouse<ol><li>Pesare il topo e indurre l'anestesia eseguendo un'iniezione intraperitoneale di 10 μL/g di peso del topo (MW) della soluzione anestetica. Quando il mouse smette di muoversi, posizionarlo su una piastra riscaldata (37 °C) e verificare che sia completamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi.</li>
		<li>Applicare una goccia di lacrima artificiale sull'occhio sottoposto all'intervento chirurgico e una goccia di gel oculare sull'occhio controlaterale.</li>
		<li>Una volta che il topo non risponde al pizzicamento, iniettare l'analgesia (0,02 mg/mL di buprenorfina) a 5 μL/g di MW per fornire 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea nel collo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Abrasione della cornea
<ol><li>Seguire il passaggio 1.3 per preparare la soluzione colorante fluorescente.</li>
	<li>Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse.</li>
	<li>Prima di eseguire l'abrasione, immergere la bava oculare in EtOH al 70% e poi in PBS per pulirla.</li>
	<li>Posizionare il mouse su una piastra riscaldata (37 °C) sul lato per accedere facilmente all'occhio sottoposto all'intervento.<ol><li>Usa un batuffolo di cotone per assorbire la lacrima artificiale e spazzola via le ciglia senza toccare l'occhio.</li>
		<li>Accendi la bava oculare, apri la palpebra del mouse con due dita e contemporaneamente blocca le vibrisse per evitare che rimangano incastrate nella bava.</li>
	</ol></li>
	<li>Localizzare la pupilla o il centro dell'occhio e applicare la bava oculare sulla superficie dell'occhio e fare movimenti circolari. Osservando da vicino, è possibile osservare la superficie dell'epitelio rimosso. Altrimenti, fai circa 20 movimenti circolari sulla cornea.</li>
	<li>Rimetti il topo sulla pancia e controlla se il gel oculare è ancora presente nell'occhio controlaterale.</li>
	<li>Applicare una goccia di soluzione colorante fluorescente sull'occhio abraso e attendere 20 s. Assorbire la goccia con un fazzoletto senza toccare l'occhio e risciacquare con una goccia di lacrima artificiale. Assorbire la goccia della lacrima artificiale con un fazzoletto e illuminare l'occhio con la lampada al cobalto blu. NOTA: L'abrasione deve avere una forma circolare. Ci vuole un po' di allenamento per ottenerlo.</li>
	<li>Applicare una goccia di gel oculare sull'occhio abraso e lasciare che il mouse si svegli sul pad riscaldato. Quando il topo si muove da solo, rimettilo nella sua gabbia.</li>
	<li>Verificare il benessere dell'animale durante i 2 giorni successivi.</li>
	<li>Dopo l'uso della fresa oculare, utilizzare un tessuto molle per rimuovere le cellule epiteliali bloccate nella testa della fresa e immergerlo in EtOH al 70% e poi PBS. NOTA: Una volta rimosse le cellule epiteliali con il tessuto molle, assicurarsi che nessun pezzo di tessuto sia bloccato nella testa della fresa.</li>
</ol>3. Assotomia dei nervi corneali
<ol><li>Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse.</li>
	<li>Posizionare il mouse sotto una lente binoculare sul lato per accedere all'occhio sottoposto all'intervento chirurgico. Metti il fondo di una capsula di Petri sotto la testa del topo in modo che l'occhio sia orizzontale. NOTA: I seguenti passaggi verranno eseguiti guardando attraverso la lente binoculare.</li>
	<li>Rimuovere la lacrima artificiale con un batuffolo di cotone e rimuovere le ciglia senza toccare l'occhio.</li>
	<li>Posiziona delle pinze lisce e curve sotto l'occhio dell'animale in modo da farlo uscire dall'orbita. Assicurati di chiudere la pinza abbastanza in modo che l'occhio non sia in grado di tornare nell'orbita una volta applicata la pressione, ma non eccessivamente per evitare danni al nervo ottico.</li>
	<li>Applicare il punzone bioptico di 2,5 mm verticalmente sull'occhio senza pressione per garantire il contatto totale del punzone con la superficie della cornea. NOTA: Una volta applicato il punzone contro la cornea, la mano dello sperimentatore potrebbe interferire con il campo visivo.</li>
	<li>Quindi, inizia ad applicare pressione e ruota il punzone più volte. NOTA: A seconda della pressione, il numero di torsioni può variare, ma generalmente è di circa 5. Richiede allenamento per sentire la giusta pressione e movimento. Se viene applicata troppa pressione, l'occhio si rompe. In questo caso, si può osservare il liquido che esce dalla lesione e l'occhio si ammorbidisce. L'animale deve essere sacrificato.</li>
	<li>Rimuovere il punzone per biopsia. Deve essere visibile un cerchio sulla cornea in cui è stato applicato il punzone bioptico. NOTA: I passaggi successivi non richiedono la lente binoculare.</li>
	<li>Controllare se l'occhio controlaterale ha ancora il gel oculare e applicarne un po' sull'occhio assotomizzato.</li>
	<li>Lascia che il mouse si svegli su un tappetino riscaldato (37 °C) e rimettilo nella sua gabbia quando si muove da solo.</li>
	<li>Verificare il benessere dell'animale durante i 2 giorni successivi.</li>
</ol>4. Elaborazione dell'intero monte corneale
<ol><li>Raccolta e fissazione del campione.<ol><li>Pesare il topo e indurre l'anestesia eseguendo un'iniezione intraperitoneale di 10 μL/g di peso del topo (MW) della soluzione anestetica.</li>
		<li>Quando il mouse smette di muoversi e non ha riflessi pizzicando le dita dei piedi, eseguire una lussazione cervicale.</li>
		<li>Estrarre l'occhio dall'orbita usando due dita ed enucleare l'occhio tagliando il nervo ottico con forbici curve.</li>
		<li>Mettere l'occhio in una provetta di plastica da 2 ml contenente PBS.</li>
		<li>Fissare l'occhio sostituendo il PBS con il 4% di paraformaldeide e ponendolo su uno shaker (30 giri/min) a temperatura ambiente (RT) per 20 min.</li>
		<li>Risciacquare 3 volte per 10 minuti con PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione della cornea<ol><li>Metti una goccia di PBS su un pezzo di parafilm all'interno di una capsula di Petri.</li>
		<li>Metti l'occhio in questa goccia di PBS.</li>
		<li>Posizionare la capsula di Petri sotto la lente binoculare.</li>
		<li>Sezionare la cornea utilizzando forbici e pinze per microdissezione. Taglia sopra il corpo ciliare per mantenere il limbus.</li>
		<li>Rimuovere il cristallino, il corpo ciliare e l'iride con una pinza fine.</li>
		<li>Rimetti la cornea in una provetta di plastica da 2 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocollo di immunofluorescenza<ol><li>Incubare la cornea in 2 ml di gelatina di pelle di pesce al 2,5%, siero di capra al 5% e detergente allo 0,5% in PBS per 1 ora a RT su uno shaker (30 giri/min).</li>
		<li>Incubare la cornea in 150 μL di una soluzione di gelatina di pelle di pesce al 2,5%, siero di capra al 5% e detergente allo 0,1% in PBS contenente l'anticorpo primario diluito a 1/1000 (anticorpo antitubulina βIII) per una notte a 4 °C su uno shaker (30 rpm).</li>
		<li>Risciacquare 3 volte per 1 ora con detersivo allo 0,1% in PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).</li>
		<li>Incubare la cornea nella stessa soluzione del passaggio 4.3.2, contenente l'anticorpo secondario diluito a 1/500 per una notte a 4 °C su uno shaker (30 giri/min).</li>
		<li>Risciacquare 3 volte per 1 h con PBS a RT su uno shaker (30 giri/min).</li>
		<li>Incubare la cornea per 10 minuti con 150 μL di DNA intercalator diluito a 1/5000 a RT su uno shaker (30 rpm).</li>
		<li>Risciacquare 2 volte per 5 minuti con PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaggio della cornea<ol><li>Posiziona la cornea su un vetrino, con l'epitelio rivolto verso il vetrino, e usa un bisturi per creare quattro sezioni senza raggiungere il centro. NOTA: Eseguire le sezioni opposte l'una all'altra per formare una forma a fiore.</li>
		<li>Posizionare l'endotelio corneale rivolto verso il vetrino e rimuovere il PBS intorno alla cornea utilizzando un fazzoletto. NOTA: Non rimuovere il PBS sotto la cornea; in caso contrario, potrebbero comparire bolle d'aria. In tal caso, aggiungere PBS alla cornea e rimuovere la bolla d'aria. Quindi riavviare dal passaggio 4.3.2.</li>
		<li>Aggiungere la pasta per modelli sui quattro angoli di un vetrino coprioggetto rettangolare. NOTA: La pasta modella eleva il vetrino coprioggetto poiché la cornea è un tessuto spesso.</li>
		<li>Far cadere 50 μL di un mezzo di montaggio sulla cornea e posare con cura il vetrino coprioggetti sopra per evitare la formazione di bolle.</li>
		<li>Sigillare il vetrino coprioggetto con lo smalto.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging<ol><li>Posizionare il vetrino sotto un microscopio a epifluorescenza.</li>
		<li>Definisci la dimensione del mosaico e la profondità dell'immagine e avvia l'acquisizione.</li>
		<li>Applicare un programma di sfocatura e deconvoluzione sull'immagine acquisita. NOTA: Il passaggio 4.6.3 è un'opzione selezionata sul software di acquisizione (Large Volume Computational Clearing [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. Ablazione laser localizzata dei nervi corneali
<ol><li>Accendere il microscopio multifotone verticale e il laser combinato con un oscillatore ottico parametrico. Attivare il tavolino riscaldato del microscopio (37 °C) e impostare i laser a 850 nm e 1100 nm, corrispondenti alle lunghezze d'onda richieste per il modello murino.</li>
	<li>Utilizzare un misuratore di potenza per impostare contemporaneamente la potenza dei laser a circa 20 mW.</li>
	<li>Seguire il passaggio 1.4 per preparare il mouse e applicare il gel oculare su entrambi gli occhi. NOTA: L'animale utilizzato per questo protocollo deve provenire da una linea murina transgenica (topo transgenicoMAGIC-Marker 21) che esprime un fluoroforo endogeno nelle fibre nervose corneali.</li>
	<li>Installa l'animale in un supporto per la testa. Ruota l'animale di 90° in modo che l'occhio di interesse sia rivolto verso il soffitto.</li>
	<li>Lega le vibrisse dell'animale per liberare la zona degli occhi. Lega il corpo dell'animale per ridurre il movimento della testa indotto dalla respirazione.</li>
	<li>Posizionare un vetrino coprioggetto circolare sull'occhio sopra il gel oculare. Il vetrino coprioggetto deve essere orizzontale. Non esitate a muovere la testa dell'animale per posizionare correttamente il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Aggiungi una goccia di PBS sopra il vetrino coprioggetti. Posizionare con cura l'animale sul tavolino del microscopio e posizionare la torretta dell'obiettivo alla giusta distanza.</li>
	<li>Utilizzare l'obiettivo acquoso 20x e l'epifluorescenza per localizzare l'occhio e l'innervazione attraverso l'oculare.</li>
	<li>Attivare i laser e definire la profondità da illuminare.</li>
	<li>Acquisizione di immagini 1024 x 1024 (pixel) a una velocità di acquisizione del 70%-85% della velocità di scansione massima.</li>
	<li>Una volta acquisita l'immagine, togliere l'animale dal microscopio e rimuovere il vetrino coprioggetto e le cinghie. Rimuovere l'animale dal supporto per la testa, aggiungere altro gel oculare se necessario e lasciarlo svegliare in una gabbia su una piastra riscaldata. NOTA: La distruzione dell'innervazione può essere osservata 1 settimana dopo l'imaging. Questo protocollo può essere ripetuto una volta alla settimana per diverse settimane per aumentare i danni causati dai laser.</li>
	<li>Quando l'animale si muove da solo, rimetti la gabbia nella stalla e controlla il suo benessere per i 2 giorni successivi.</li>
</ol>

Protocolli di danno alle fibre sensoriali corneali per studi sulla rigenerazione degli assoni

<ol>
	<li>Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+corneal+innervation.">Anatomy of the human corneal innervation.</a> Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).</li><li>Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+nerves+in+health+and+disease.">Corneal nerves in health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).</li><li>Dua, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratopathy.">Neurotrophic keratopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).</li><li>Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratitis.">Neurotrophic keratitis.</a> Eye. 17 (8), 989-995 (2003).</li><li>Barrientez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury:+Clinical+and+molecular+aspects.">Corneal Injury: Clinical and molecular aspects.</a> Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).</li><li>Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury.">Corneal Injury.</a> StatPearls. , (2023).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye.">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).</li><li>Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+corneal+insult+in+Zebrafish+results+in+a+bilateral+cell+shape+and+identity+modification,+supporting+wound+closure.">Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+through+molecular+mechanisms+mediated+via+the+Neurokinin-1+receptor.">Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor.</a> Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).</li><li>Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+corneal+wound+healing+using+exosome-mediated+targeting+of+NF-&#954;B+c-Rel.">Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-&#954;B c-Rel.</a> Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).</li><li>Downie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+sub-basal+nerve+plexus+and+superficial+nerve+terminals+after+corneal+epithelial+injury+in+mice.">Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice.</a> Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).</li><li>He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+substance+P+sensory+nerves+and+transient+receptor+potential+melastatin+8+(TRPM8)+cold+receptors+after+corneal+experimental+surgery.">Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).</li><li>Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+reinnervation+following+refractive+surgery+treatments.">Corneal reinnervation following refractive surgery treatments.</a> Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).</li><li>Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+corneal+subbasal+nerve+density+after+PRK+and+LASIK.">Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK.</a> Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+WldS,+and+Nmnat.">Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+corneal+transplantation.">Lamellar corneal transplantation.</a> Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).</li><li>Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+innervation+and+cellular+changes+after+corneal+transplantation:+An+in+vivo+confocal+microscopy+study.">Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+protection+in+the+cornea:+Failure+and+rescue.">UV protection in the cornea: Failure and rescue.</a> Biology. 11 (2), 278 (2022).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+cell+and+lineage+tracking+with+combinatorial+labels.">Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Dana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+identification,+diagnosis,+and+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy.</a> BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+serum+application+in+the+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy.</a> Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).</li><li>Bonini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized,+double-masked,+vehicle-controlled+trial+of+recombinant+human+nerve+growth+factor+for+neurotrophic+keratitis.">Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis.</a> Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).</li><li>Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+autologous+serum+tears+for+treatment+of+neuropathic+corneal+pain.">Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain.</a> Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).</li><li>Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+keratoplasty+techniques.">Lamellar keratoplasty techniques.</a> Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).</li><li>Gautier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV2/9-mediated+gene+transfer+into+murine+lacrimal+gland+leads+to+a+long-term+targeted+tear+film+modification.">AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

La cheratite neurotrofica è considerata una malattia rara, che colpisce 5 individui su 10.000. Tuttavia, le persone che soffrono di NK a causa di una lesione fisica come ustioni chimiche o sindromi come il diabete o la sclerosi multipla non sono incluse in tali statistiche3. Inoltre, questa condizione rimane significativamente sottodiagnosticata22 e la prevalenza della malattia è sottostimata. C'è un forte bisogno di nuovi trattamenti e terapie che promuovano la rigenera...

La cornea, che è la superficie trasparente dell'occhio, è composta da tre strati distinti: l'epitelio, lo stroma e l'endotelio. Questo organo ha la più alta densità di innervazione nel corpo ed è composto principalmente da fibre sensoriali (tipi Aδ e C) che originano dal ramo oftalmico del ganglio trigemino. Le fibre sensoriali penetrano nella periferia della cornea nello stroma medio sotto forma di grandi fasci che si ramificano per coprire la superficie. Quindi si biforcano per perforare la membrana di Bowmann e formare il plesso sottobasale, che è facilmente riconoscibile per la formazione di un vortice al centro della cornea. Queste fibre terminano come terminazioni nervose libere sulla superficie esterna dell'epitelio. Sono in grado di trasdurre stimoli termici, meccanici e chimici e di rilasciare fattori trofici essenziali per l'omeostasi dell'epitelio 1,2. La cheratite neurotrofica (NK) è una malattia degenerativa che colpisce l'innervazione sensoriale corneale. Questa malattia rara deriva da una diminuzione o da una perdita della sensibilità corneale che si traduce in una minore produzione di lacrime e scarse proprietà curative della cornea3. La NK progredisce attraverso tre fasi ben descritte, dalla fase 1 in cui i pazienti soffrono di difetti epiteliali, alla fase 3 in cui si verificano la fusione stromale e/o la perforazione corneale4.
Dal punto di vista clinico, le origini di questa malattia possono essere diverse. I pazienti possono perdere l'innervazione corneale dopo lesioni fisiche all'occhio, interventi chirurgici o malattie croniche, come il diabete 5,6. Ad oggi, il processo di patogenesi delle NK rimane poco compreso e le opzioni terapeutiche per questa condizione pericolosa per la vista sono molto limitate. Pertanto, è necessaria una migliore comprensione delle caratteristiche dei difetti epiteliali per comprendere meglio i meccanismi alla base della rigenerazione di tali fibre e potenzialmente promuoverle. Qui, proponiamo diversi modelli di lesioni corneali che inducono NK nei topi.
Il primo modello è l'abrasione dello strato epiteliale della cornea con una bava oculare. Questo modello è stato studiato principalmente nel contesto della rigenerazione dell'epitelio in diversi animali, come roditori e pesci 7,8,9, e per testare molecole che promuovono la guarigione corneale10,11. Fisiologicamente, ci vogliono 2-3 giorni perché le cellule epiteliali chiudano la ferita. Il modello fisiologico dell'innervazione, tuttavia, impiega più di quattro settimane per riprendersi dall'abrasione12,13. Durante l'intervento chirurgico, la bava oculare rimuove lo strato epiteliale della cornea che contiene il plesso sottobasale e le terminazioni nervose libere delle fibre. Questa procedura può essere clinicamente paragonata a quella dei pazienti con cheratectomia fotorefrattiva (PRK) per correggere i difetti refrattivi oculari. La procedura consiste nell'asportazione dell'epitelio della cornea e nel rimodellamento dello stroma con un laser14. I pazienti possono manifestare diversi effetti collaterali a seguito di tale intervento chirurgico, come una diminuzione della densità del nervo corneale per 2 anni e una riduzione della sensibilità per una durata da 3 mesi a un anno dopo l'intervento chirurgico15. Dato che l'intervento chirurgico induce una fragilità del microambiente corneale, questo modello potrebbe aiutare a studiare questi effetti collaterali e sviluppare approcci terapeutici che promuoverebbero una reinnervazione più rapida, riducendo così gli effetti collaterali in questione.
Il secondo modello consiste nel sezionare gli assoni alla periferia della cornea con un punzone bioptico, inducendo una degenerazione walleriana dell'innervazione centrale 16. Dal punto di vista clinico, questo metodo potrebbe essere paragonato alla cheratoplastica lamellare anteriore, in cui il chirurgo realizza una trapanazione parziale della cornea per rimuovere una parte dello spessore anteriore della cornea e sostituirla con un trapianto da donatore 17. Dopo la cheratoplastica lamellare, i pazienti possono soffrire di una serie di sintomi tra cui secchezza oculare, perdita di innervazione corneale e rigetto del trapianto18. Questo modello di assotomia eseguito sui nervi corneali potrebbe fornire informazioni sui meccanismi della degenerazione delle fibre, che si verifica dopo un innesto, seguita dalla rigenerazione degli assoni.
Il terzo metodo danneggia i nervi corneali con un laser. Utilizzando un microscopio multifotone sulla cornea di animali anestetizzati viene indotta la degenerazione dei nervi localizzati nel campo ottico a seguito della formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che porta al danno del DNA e alla cavitazione cellulare19. Questo metodo ricapitola il fotodanno corneale indotto dalla sovraesposizione ai raggi UV naturali (scottature solari), che innesca anche la formazione di ROS, portando al danno al DNA20. I pazienti che soffrono di scottature solari corneali provano un grande dolore, poiché il deterioramento delle cellule epiteliali priva le estremità delle fibre corneali di tutto.
I tre metodi qui descritti sono progettati per consentire lo studio del processo di patogenesi NK e della rigenerazione degli assoni. Sono facilmente riproducibili e precisi. Inoltre, consentono un rapido recupero e un facile monitoraggio degli animali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

La cornea è un tessuto trasparente che copre l'occhio ed è fondamentale per una visione chiara. È il tessuto più innervato del corpo. Questa innervazione fornisce sensibilità e funzione trofica all'occhio e contribuisce a preservare l'integrità corneale. L'interruzione patologica di questa innervazione è definita cheratite neurotrofica. Questo può essere innescato da lesioni all'occhio, interventi chirurgici o malattie. In questo studio, proponiamo tre diversi protocolli per infliggere danni all'innervazione in modi che ricapitolano i tre tipi di casi generalmente riscontrati in clinica.
Il primo metodo consiste nell'effettuare un'abrasione dell'epitelio con una fresa oftalmica. Ciò comporta la rimozione dello strato epiteliale, delle terminazioni nervose libere e del plesso sottobasale in modo simile all'intervento di cheratectomia fotorefrattiva eseguito in clinica. Il secondo metodo mira solo all'innervazione sezionandola alla periferia con un punzone da biopsia, mantenendo l'integrità dell'epitelio. Questo metodo è simile alle prime fasi della cheratoplastica lamellare e porta a una degenerazione dell'innervazione seguita dalla ricrescita degli assoni nella cornea centrale. L'ultimo metodo danneggia l'innervazione di un modello murino transgenico utilizzando un microscopio multifotone, che localizza in modo specifico il sito di cauterizzazione delle fibre nervose fluorescenti. Questo metodo infligge gli stessi danni della fotocheratite, una sovraesposizione alla luce UV.
Questo studio descrive diverse opzioni per studiare la fisiopatologia dell'innervazione corneale, in particolare la degenerazione e la rigenerazione degli assoni. Promuovere la rigenerazione è fondamentale per evitare complicazioni come difetti dell'epitelio o persino la perforazione della cornea. I modelli proposti possono aiutare a testare nuove molecole farmacologiche o terapie geniche che migliorano la rigenerazione nervosa e limitano la progressione della malattia.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'innervazione corneale attraverso modelli innovativi 

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

The cornea, which is the transparent tissue covering the eye, requires a balanced microenvironment to maintain its integrity. The dense innervation of the cornea participates to this microenvironment. If there is a loss, which could be partial or total, of this innervation, then a specific condition arises, which is called neurotrophic keratitis.To find new cures and efficient cures for this disease, we need to have specific models. The expansion of the use of transgenic animal bearing fluorescent reporters and microscopic advances have opened new possibilities in visualizing axonary generation. In vivo imagine has become more accessible to any research lab willing to follow the neurogeneration process.The various causes inducing neurotrophic keratitis underlying the difficulties of having only one model to test nerve regeneration therapies. These three models are reproducing various situations seen in clinics, and sharing those methods will allow other labs to uncover new aspects of corneal innervation from which innovative treatments will be designed.

Questo studio propone diversi protocolli per infliggere danni all'innervazione corneale nei topi. Mentre protocolli simili sono stati utilizzati per studiare la fisiopatologia della guarigione dell'epitelio, abbiamo scelto di adattare e sviluppare nuovi metodi per studiare la rigenerazione dell'innervazione corneale. Per osservare l'innervazione, abbiamo usato due tecniche. In primo luogo, abbiamo impiegato una tecnica di immunofluorescenza per colorare le fibre nervose utilizzando un anticorpo pan-neuronale (tubulina BI...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Corneal Innervation Research Through Innovative Models at JoVE.com

Qui proponiamo tre diversi metodi per danneggiare le fibre sensoriali che innervano la cornea. Questi metodi facilitano lo studio della rigenerazione degli assoni nei topi. Questi tre metodi, adattabili ad altri modelli animali, sono ideali per lo studio della fisiologia e della rigenerazione dell'innervazione corneale.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

La cornea, che è il tessuto trasparente che ricopre l'occhio, richiede un microambiente equilibrato per mantenere la sua integrità. La densa innervazione della cornea partecipa a questo microambiente. Se c'è una perdita, che potrebbe essere parziale o totale, di questa innervazione, si verifica una condizione specifica, che si chiama cheratite neurotrofica.Per trovare nuove cure e cure efficaci per questa malattia, abbiamo bisogno di modelli specifici. L'espansione dell'uso di reporter fluorescenti transgenici e i progressi microscopici hanno aperto nuove possibilità nella visualizzazione della generazione assonaria. L'immagine in vivo è diventata più accessibile a qualsiasi laboratorio di ricerca disposto a seguire il processo di neurogenerazione.Le varie cause che inducono la cheratite neurotrofica sono alla base delle difficoltà di avere un solo modello per testare le terapie di rigenerazione nervosa. Questi tre modelli riproducono varie situazioni viste in clinica e la condivisione di questi metodi consentirà ad altri laboratori di scoprire nuovi aspetti dell'innervazione corneale da cui verranno progettati trattamenti innovativi.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

996 Views.  University of  Montpellier, INSERM. La cornea, che è il tessuto trasparente che ricopre l'occhio, richiede un microambiente equilibrato per mantenere la sua integrità. La densa innervazione della cornea partecipa a questo microambiente. Se c'è una perdita, che potrebbe essere parziale o totale, di questa innervazione, si verifica una condizione specifica, che si chiama cheratite neurotrofica.Per trovare nuove cure e cure efficaci per questa malattia, abbiamo bisogno di modelli specifici. L'espansione dell'uso di repor...

Video: Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'innervazione corneale attraverso modelli innovativi 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Ricerca

Neuroscienze

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

Abrasione del nervo corneale murino per l'induzione della cheratite neurotrofica

Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal nerve axotomy, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Position the mouse under a binocular loupe to assess the eye that is being operated on. Place the bottom of a Petri dish under the mouse's head to keep the eye horizontal. With a cotton swab, carefully dad the artificial tear from the eye and remove the eyelashes without touching the eye.Place a pair of smooth curved pillars under the animal's eye and gently pop it out of the orbit. Gently place a biopsy punch vertically against the cornea surface, apply pressure, and twist the punch several times. Then, remove the biopsy punch and a circular mark should be visible on the cornea.A thin peripheral ring was seen at the point where the biopsy punch was applied, which damaged the basal epithelium. The peripheral nerves appeared to be sectioned, triggering the Wallerian axon degeneration. Heavy degeneration was observed, leading to total loss of innervation in the cornea center.This resulted in the disintegration of the epithelial layer, creating an ulcer.

Axotomia del nervo corneale murino per l'induzione della cheratite neurotrofica

Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of ocular gel on both eyes. Place the animal in a head holder to secure its position.Rotate the animal by 90 degrees so that the eye being operated on faces the ceiling. Secure the animal's vibrancy to clear the area around the eye. Secure the animal's body to minimize head movements caused by breathing.Place a circular cover slip horizontally over the eye on top of the ocular gel. Adjust the animal's head as necessary to correctly position the cover slip. Add a drop of PBS on top of the cover slip, then carefully place the animal onto a microscope stage.Adjust the objective turret of the microscope to the appropriate distance for observation. Activate the lasers to induce corneal nerve ablation. Once nerve ablation is complete, remove the animal from the head holder and place it in a cage on a heated plate.The vortex was visibly absent one week after laser ablation. A group of immune cells were observed to have migrated to the illumination site. The stromal fiber bundles appeared to have thinned out.