Questo studio è stato finanziato dal programma chiave della Fondazione per le scienze naturali di Chongqing (n. cstc2020jcyj-zdxmX0027) e dal progetto della Fondazione nazionale cinese per le scienze naturali (n. 32270988).

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida all'uso e alla cura degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per il benessere e l'etica degli animali da laboratorio della Terza Università medica militare.
1. Preparazione di nanoemulsioni (EN)
<ol><li>Per la preparazione in fase acquosa, sciogliere 0,15 g di polisorbato 80 in 28,2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) agitando a 40 °C.</li>
	<li>Per la preparazione in fase oleosa, utilizzare la formulazione in fase oleosa della nanoemulsione mostrata nella Tabella 1. Sciogliere il trileato di sornitano 85, il DOTAP e l'AR nello squalene agitando a 40 °C.</li>
	<li>Per la preparazione dell'emulsione O/W primaria, agitare magneticamente la fase oleosa a 1400 giri/min aggiungendo l'acquosa lentamente e goccia a una velocità di 1 mL/min. Pre-emulsionare la miscela utilizzando un emulsionante ad alto taglio a 30.000 giri/min per 6 minuti.</li>
	<li>Per l'omogeneizzazione ad alta pressione (HPH), trattare l'emulsione O/W primaria preparata sopra con un omogeneizzatore ad alta pressione per 12 cicli a 900 bar per ottenere una nanoemulsione omogenea nell'intervallo 160-190 nm.</li>
	<li>Al termine del processo, raccogliere l'emulsione in un pallone da 50 ml e sterilizzare l'emulsione con filtro attraverso una membrana filtrante in PES da 0,2 μm.</li>
	<li>Collegare il pallone alla linea Schlenk attraverso il catetere, ruotando il rubinetto a tre vie per collegare il sistema al tubo del vuoto e accendere la pompa del vuoto per creare il vuoto nel pallone. Quindi, ruotando il rubinetto a tre vie, collegare il sistema al tubo di Argon e riempirlo di Argon. Ripetere questo passaggio 3 volte per assicurarsi che il pallone sia pieno di Argon.</li>
	<li>Rimettere il tappo e sigillare con una pellicola di paraffine, avvolgere il matraccio in un foglio di stagnola e conservarlo a 4 °C.</li>
</ol>2. Caratterizzazione delle nanoemulsioni
<ol><li>Rilevamento delle dimensioni delle particelle e del potenziale zeta<ol><li>Accendere lo strumento e attendere 30 minuti affinché la sorgente di luce laser si stabilizzi.</li>
		<li>Diluire l'NE 50 volte con acqua ultrapura e aggiungere 1 mL di campione alla cella del campione corrispondente.</li>
		<li>Per misurare la dimensione delle particelle, impostare la temperatura a 25 °C, selezionare l'acqua come mezzo di dispersione e selezionare le piastre di plastica monouso come cella di misura. Caricare i campioni e misurare automaticamente. Riportare il valore medio di tre misurazioni ripetute per ciascun campione come risultato finale.</li>
		<li>Per la misurazione del potenziale zeta, impostare la temperatura a 25 °C. A causa della scelta della fase acquosa come mezzo di dispersione, selezionare il modello Smoluchowsi e la cella capillare ripiegata come cella di misura. Caricare i campioni e misurare automaticamente. Riportare la media di tre misurazioni replicate per ciascun campione come risultato finale.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinazione della velocità di incapsulamento e della velocità di carico del farmaco<ol><li>Per determinare la quantità di AR caricata nel NE, utilizzare etanolo assoluto per demulsificare ed estrarre l'AR dal NE. A 5 μl di campione, aggiungere 995 μl di etanolo e determinare il contenuto di AR della soluzione utilizzando uno spettrofotometro a 355 nm. Confrontare l'assorbanza con una curva standard. Utilizzare la seguente equazione: Incapsulamento = carico effettivo di AR/peso del farmaco aggiunto Velocità di caricamento del farmaco = carico effettivo di AR / qualità del campione</li>
	</ol></li>
</ol>3. Procedure di immunizzazione e raccolta dei campioni
<ol><li>Procedura di immunizzazione e raggruppamento<ol><li>Gruppo topi Balb/C femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane e del peso di circa 18-21 g in set da 5 per l'immunizzazione il giorno 0, il giorno 14, il giorno 28 secondo i seguenti gruppi sperimentali: (1) gruppo PBS, (2) gruppo ovoalbumina (OVA), (3) gruppo OVA+ NE-RA (OVA/NE-RA), (4) gruppo OVA+CNE-RA (OVA/CNE-RA).</li>
		<li>Immunizzare tutti i topi mediante iniezione intramuscolare nei muscoli del quadricipite superiore con 200 μL di diverse formulazioni di vaccino: 100 μL di emulsione e 15 μg di OVA assorbiti in 100 μL di PBS, miscelati prima della somministrazione. Iniettare 100 μL/zampa posteriore. Per i topi nel gruppo di controllo, somministrare solo PBS.</li>
		<li>Eutanasia: eutanasia di tutti i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di pentobarbital sodico all'1% 2 settimane dopo il completamento delle tre vaccinazioni.</li>
		<li>Raccolta ed elaborazione del campione: dopo l'eutanasia, utilizzare le forbici per aprire il torace dei topi e inserire una siringa direttamente nel cuore per aspirare circa 0,5 ml di sangue intero. Lasciare riposare il sangue per 2 ore a temperatura ambiente e poi centrifugare a 1800 x g per 5 minuti a 4 °C. Raccogliere il siero, l'aliquota e conservare a -80 °C per ulteriori analisi.</li>
		<li>Raccogliere sangue intero, milza, liquido di lavaggio vaginale (VLF), liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF), liquido di lavaggio nasale (NLF) e liquido di lavaggio dell'intestino tenue (SILF).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento dei linfociti splenici<ol><li>Immergere i topi in etanolo al 75% (v/v) per una breve sterilizzazione, trasferire i topi su un banco pulito. Tagliare la pelle sull'addome sinistro con le forbici, esporre e rimuovere la milza.</li>
		<li>Mettere la milza in una capsula di Petri contenente 3 mL di PBS, macinare e filtrare in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un setaccio (200 mesh, 70 μm) e un'asta di macinazione.</li>
		<li>Centrifugare le celle a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e sospendere il precipitato con 3 mL di soluzione di lisi dei globuli rossi, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di PBS alla provetta e agitare bene per terminare la reazione, quindi centrifugarla a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS, aggiungere 20 μL della diluizione cellulare al contatore cellulare automatico per il conteggio delle cellule.</li>
		<li>Centrifugare le celle a 650 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e diluire le cellule a 1 x 106 cellule/mL con 1640 terreno completo (1% penicillina-streptomicina, 10% siero fetale bovino).</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta VLF: Sciacquare la vagina 4 volte con 75 μL di 1%BSA/PBST, combinare la soluzione di lavaggio e raccogliere in provette da centrifuga da 1,5 mL, centrifugare a 5000 x g a 4 °C per 20 minuti e raccogliere il surnatante con una pipetta e conservare a -80 °C.</li>
	<li>Collezione BALF e NLF<ol><li>Disinfettare i topi dopo il sacrificio con etanolo al 75% (v/v). Tieni il mouse a pancia in su e raddrizza il collo. Usa le forbici per praticare un'incisione longitudinale nella pelle del collo del topo e usa una pinza per separare i muscoli ed esporre adeguatamente la trachea.</li>
		<li>Tagliare la trachea attraverso una piccola apertura trasversale e inserire il tubo verso i polmoni, collegare la siringa al tubo e iniettare 0,5 mL di PBS nei polmoni ed estrarre, ripetere il risciacquo 3 volte e centrifugare a 650 x g a 4 °C per 5 minuti, conservare il surnatante (BALF) a -80 °C.</li>
		<li>Invertire il tubo nella cavità nasale, collegare la siringa al tubo e iniettare 0,5 ml di PBS, il liquido scorrerà attraverso la cavità nasale nella provetta da centrifuga da 1,5 ml. Aspirare il lavaggio dalla provetta da centrifuga e ripetere il risciacquo 2 volte, quindi centrifugare a 650 x g a 4 °C per 5 min, conservare il surnatante (NLF) a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Collezione SILF<ol><li>Preparare una soluzione di PBS contenente 0,1 mg/mL di inibitore della tripsina, 50 mM/L DI EDTA-2Na, 1 mM/L di fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) come soluzione di lavaggio dell'intestino tenue. Mescolare a temperatura ambiente per sciogliere e conservare a 4 °C.</li>
		<li>Tagliare l'intestino tenue lungo il tubo intestinale e immergerlo in 3 ml di liquido di lavaggio intestinale tenue. Mescolare agitando verticalmente a 15 giri/min per 30 minuti a 4 °C. Centrifugare a 1440 x g a 4 °C per 20 minuti e raccogliere il surnatante con una pipetta, quindi centrifugare a 5000 x g a 4 °C per 20 minuti. Conservare il surnatante (SILF) a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Valutazione della risposta anticorpale specifica per le OVA dopo somministrazione intramuscolare
<ol><li>Determinare i livelli sierici di IgG, le sottoclassi di IgG1, IgG2a e i livelli di sIgA specifiche in VLF, BALF, NLF e SILF mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).</li>
	<li>Per il rivestimento dell'antigene, diluire l'OVA a 5 μg/mL con il tampone di rivestimento e rivestire le piastre ELISA a 96 pozzetti per una notte a 4 °C con 100 μL di soluzione OVA per pozzetto.</li>
	<li>Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST e bloccare mediante incubazione con 250 μl di 1%BSA/PBST a 37 °C per 2 ore.</li>
	<li>Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST, quindi aggiungere 100 μl del campione diluito come descritto di seguito da testare e incubare a 37 °C per 1 ora. Siero diluito, VLF, BALF, NLF con 0,5% BSA/PBST, SILF diluito con siero fetale di vitello al 20% (FCS)/PBST.<ol><li>Iniziare diluendo il siero 1000 volte utilizzando una procedura di diluizione in due fasi: diluire 20 μL di siero a 1 mL, quindi diluire 25 μL di questo siero diluito a 500 μL. Utilizzare questa diluizione del siero per la rilevazione di IgG1, IgG2a.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 200 μl di siero diluito a 1000x alla prima fila della piastra rivestita e aggiungere 100 μl di BSA/PBST allo 0,5% a tutti i pozzetti tranne la prima fila. Trasferire 100 μl dalla prima alla seconda fila e mescolare 10 volte con la pipetta. Ripetere questo passaggio fino alla riga 8 e scartare 100 μL di liquido, il siero di diverse concentrazioni è stato ottenuto per la rilevazione delle IgG.</li>
	<li>Eseguire una diluizione 1:1 di BALF, NLF e SILF per rilevare le IgA. Utilizzare la stessa procedura di diluizione per VLF come quella per il siero.</li>
	<li>Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST. Aggiungere 100 μL di IgG/IgG1/IgG2a/IgA di capra anti-topo coniugate con HRP (diluite 1:10000 con PBST) nei pozzetti appropriati e incubare a 37 °C per 40 minuti.</li>
	<li>Lavare le piastre ELISA 5 volte con PBST, aggiungere 100 μl di substrato ELISA TMB (altamente sensibile) e trasferire la piastra in un luogo protetto dalla luce per 5 minuti. Aggiungere immediatamente 100 μl di soluzione di arresto a 450 nm per il substrato TMB per arrestare la reazione.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza (OD) a 450 nm per ciascun pozzetto e calcolare il titolo anticorpale prendendo 2,1 volte il valore sierico del topo del gruppo bianco come valore di risposta positiva.</li>
</ol>5. Saggio ELISpot
<ol><li>Seguire le linee guida per ELISpot Plus, utilizzare Mouse IFN-γ (ALP) del kit per eseguire i saggi.</li>
	<li>Rimuovere la piastra dalla confezione sigillata e lavare 4 volte con PBS sterile (200 μL/pozzetto). Condizionare la piastra con 1640 terreno completo (200 μL/pozzetto) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il terreno e aggiungere alla piastra la concentrazione aggiustata di sospensione linfocitaria preparata al punto 3.2.2 (100 μL/pozzetto), quindi aggiungere 100 μL dello stimolo, ovvero 1640 terreno completo contenente 20 μg/mL di terreno completo OVA257~264 o OVA323~339 o 1640. Porre la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C con il 5% di CO2 per 48 ore. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Eliminare la sospensione cellulare e lavare la piastra 5 volte con PBS (200 μL/pozzetto). Diluire l'anticorpo di rilevazione (R4-6A2-biotina) a 1 μg/mL in PBS contenente lo 0,5% di siero fetale di vitello (PBS-0,5% FCS). Aggiungere 100 μL/pozzetto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la piastra come al punto 5.2. Diluire la streptavidina-ALP (1:1000) in PBS-0,5%FCS e aggiungere 100 μL/pozzetto, incubare per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la piastra come al punto 5.2. Filtrare la soluzione di substrato pronta all'uso (BCIP/NBT-plus) attraverso un filtro da 0,45 μm e aggiungere 100 μL/pozzetto. Sviluppa fino a quando non emergono macchie distinte.</li>
	<li>Arrestare lo sviluppo del colore lavando abbondantemente in acqua di rubinetto, rimuovere la plastica morbida e lasciare asciugare la piastra.</li>
	<li>Ispeziona e conta i punti in un lettore ELISpot.</li>
</ol>6. Analisi statistica
<ol><li>Analizzare le differenze tra i dati di 4 gruppi mediante ANOVA unidirezionale seguita da confronto multiplo Tukey post-test. Esprimere tutti i risultati come media ± SD. Il valore P inferiore a 0,05 è stato considerato significativo.</li>
</ol>

Valutazione dell'immunogenicità dell'acido retinoico incapsulato con nanoemulsione nei topi

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse in questo lavoro.

In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Rispetto ai tradizionali adiuvanti NE, presenta i seguenti due vantaggi. In primo luogo, in generale, la superficie degli O/W EN ha un'elevata carica negativa, che rende difficile caricare direttamente gli antigeni. Le EN cationiche possono adsorbire efficacemente antigeni peptidici o proteici e migliorare l'immunogenicità specifi...

Gli adiuvanti sono spesso utilizzati per migliorare l'efficacia di un vaccino stimolando il sistema immunitario a rispondere più fortemente al vaccino, aumentando così l'immunità a un particolare agente patogeno1. L'adiuvante della nanoemulsione (NE) si riferisce a un sistema di dispersione colloidale con stabilità termodinamica emulsionando una certa proporzione di fase oleosa e fase acquosa per produrre un'emulsione sotto forma di acqua-in-olio (W/O) o olio-in-acqua (O/W)2. L'adiuvante di nanoemulsione O/W può produrre citochine e chemochine nel sito di iniezione, indurre la rapida aggregazione e proliferazione di importanti cellule immunitarie come monociti, neutrofili ed eosinofili, migliorare la risposta immunitaria e migliorare l'immunogenicità degli antigeni3. Attualmente, tre adiuvanti di nanoemulsione (MF59, AS03 e AF03) sono stati autorizzati per l'uso nei vaccini e hanno dimostrato una buona sicurezza ed efficacia4.
Tuttavia, l'immunità della mucosa è stata scarsamente affrontata dalle formulazioni adiuvanti attualmente autorizzate nella vaccinazione parenterale convenzionale5. È stato riportato che l'acido retinoico (RA) induce l'homing intestinale delle cellule immunitarie, ma la sua bassa polarità, la scarsa solubilità in acqua e la scarsa stabilità alla luce e termica ne limitano l'uso per una robusta vaccinazione enterica. Le nanoemulsioni offrono l'opportunità di aumentare la biodisponibilità di farmaci altamente lipofili e il nucleo oleoso degli adiuvanti per emulsioni O/W è adatto per sciogliere sostanze non polari come l'artrite reumatoide6. Pertanto, le nanoemulsioni possono essere utilizzate come vettori per l'artrite reumatoide al fine di ottenere il duplice effetto di risposta dell'immunità sistemica e dell'immunità della mucosa.
Rispetto ai sistemi di rilascio neutri o anionici, i sistemi di rilascio cationico hanno capacità di incapsulamento e rilascio dell'antigene relativamente efficienti, che possono migliorare l'immunogenicità degli antigeni 7,8,9. La carica cationica superficiale di una varietà di sistemi adiuvanti è importante per i loro effetti adiuvanti 10,11,12. La carica cationica è un fattore importante nel prolungare la ritenzione del vaccino nel sito di iniezione, aumentando la presentazione dell'antigene e prolungando la stimolazione dell'immunità cellulare nel corpo12.
Sulla base delle considerazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato una nanoemulsione cationica per co-fornire efficacemente AR e antigeni. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta della nanoemulsione sono stati determinati utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e le risposte immunitarie sistemiche e mucose della nanoemulsione combinata con OVA sono state valutate mediante iniezione intramuscolare13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1640 medium</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>450 nm Stop Solution for TMB Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171529-1000 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>Countstar, China</td>
			<td>IC1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>B2064-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td>5811000398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danamic Light Scattering</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano S90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOTAP</td>
			<td>CordenPharma, Switzerland</td>
			<td>O02002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)</td>
			<td>mabtech</td>
			<td>ab205719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO, USA</td>
			<td>10099141C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-function Microplate Reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>VL0000D2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97240-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97235-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab205720-500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat&#160;Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97245-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure homogenizer</td>
			<td>ATS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANE 85 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>L12910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MONTANOX 80 PPI</td>
			<td>SEPPIC, France</td>
			<td>36372K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA257&#8211;264</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OVA323-339</td>
			<td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>ZSGB-bio</td>
			<td>ZLI-9061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>R1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid</td>
			<td>TCI, Japan</td>
			<td>TCI-R0064-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squalene</td>
			<td>Sigma, USA</td>
			<td>S3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T10 basic Ultra-Turrax</td>
			<td>IKA, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB ELISA Substrate</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab171523-1000ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin inhibitor</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A003570-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Macklin, China</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>U-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid as an adjuvant to promote ova&#45;specific systemic and mucosal responses

Le nanostrutture cationiche sono emerse come un adiuvante e un sistema di rilascio dell'antigene che migliora la maturazione delle cellule dendritiche, la generazione di ROS e l'assorbimento dell'antigene e quindi promuove risposte immunitarie antigene-specifiche. Negli ultimi anni, l'acido retinoico (RA) ha ricevuto una crescente attenzione per il suo effetto nell'attivare la risposta immunitaria della mucosa; tuttavia, per utilizzare l'artrite reumatoide come adiuvante della mucosa, è necessario risolvere il problema della sua dissoluzione, carico e consegna. Qui, descriviamo un sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato in nanoemulsione cationica (CNE-RA) composto dal lipide cationico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), acido retinoico, squalene come fase oleosa, polisorbato 80 come tensioattivo e trioleato di sorbitano 85 come co-tensioattivo. Le sue proprietà fisiche e chimiche sono state caratterizzate utilizzando la diffusione dinamica della luce e uno spettrofotometro. L'immunizzazione dei topi con la miscela di antigene (ovoalbumina, OVA) e CNE-RA ha aumentato significativamente i livelli di immunoglobulina A secretoria anti-OVA (sIgA) nel liquido di lavaggio vaginale e nel liquido di lavaggio dell'intestino tenue dei topi rispetto al solo OVA. Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione, la caratterizzazione e la valutazione dell'effetto adiuvante di CNE-RA.

Adjuvants are often used to enhance the efficacy of a vaccine by stimulating the immune system to respond more strongly to the vaccine, thereby increasing immunity to a particular pathogen1. Nanoemulsion (NE) adjuvant refers to a colloidal dispersion system with thermodynamic stability by emulsifying a certain proportion of oil phase and aqueous phase to produce an emulsion in the form of water-in-oil (W/O) or oil-in-water (O/W)2. O/W nanoemulsion adjuvant can produce cytokines and chemokines at the injection site, induce the rapid aggregation and proliferation of important immune cells such as monocytes, neutrophils, and eosinophils, and enhance the immune response, and improve the immunogenicity of antigens3. Currently, three nanoemulsion adjuvants (MF59, AS03, and AF03) have been licensed for use in vaccines and have shown good safety and efficacy4.
However, mucosal immunity has been poorly addressed by the currently licensed adjuvant formulations in conventional parenteral vaccination5. Retinoic acid (RA) has been reported to induce intestinal homing of immune cells, but its low polarity, poor solubility in water, and poor light and thermal stability limit its use for robust enteric vaccination. Nanoemulsions offer opportunities to increase the bioavailability of highly lipophilic drugs, and the oil core of O/W emulsion adjuvants is suitable for dissolving non-polar substances such as RA6. Therefore, nanoemulsions can be used as carriers for RA in order to achieve the dual response effect of systemic immunity and mucosal immunity.
Compared to neutral or anionic delivery systems, cationic delivery systems have relatively efficient antigen encapsulation and delivery capabilities, which can enhance the immunogenicity of antigens7,8,9. The cationic surface charge of a variety of adjuvant systems is important for their adjuvant effects10,11,12. The cationic charge is an important factor in prolonging vaccine retention at the injection site, increasing antigen presentation and prolonging the stimulation of cellular immunity in the body12.
Based on the above considerations, we developed a cationic nanoemulsion to effectively co-deliver RA and antigens. The particle size and zeta potential of the nanoemulsion were determined using dynamic light scattering (DLS), and the systemic and mucosal immune responses of the nanoemulsion combined with OVA were evaluated by intramuscular injection13.

Autore in primo piano: Sviluppo e valutazione di un sistema di acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica per la vaccinazione della mucosa

Acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose specifiche per le OVA

We are working on a mucosal vaccine that produces an immune response as the set of infection, which has the potential to prevent infection and interrupt transmission. We have developed a catatonic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid delivery system immunization with ovalbumin by intramuscular injection, which triggers both systemic and mucosal immune responses. In future studies, animal models of intestinal-related diseases can be used to further evaluate the effect and the mechanism of a cationic nanoemulsion-encapsulated retinoic acid in enhancing vaccine protection.

In totale, sono state preparate quattro formulazioni di nanoemulsioni caratterizzate dalla dimensione delle particelle (Figura 1), dal potenziale zeta e dall'efficienza di incapsulamento, come presentato nella Tabella 2. La dimensione delle particelle era concentrata intorno a 160-190 nm e l'aggiunta di DOTAP ha invertito il potenziale Zeta della nanoemulsione. Le IgG sieriche specifiche per gli OVA e il livello di anticorpi del suo sottogruppo nel siero sono stati rilevati ...

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In questo protocollo, abbiamo sviluppato un acido retinoico (RA) incapsulato in nanoemulsione cationica da utilizzare come adiuvante per promuovere risposte sistemiche e mucose antigene-specifiche. Aggiungendo l'artrite reumatoide approvata dalla FDA alla nanoemulsione, le sIgA antigene-specifiche sono state promosse nella vagina e nell'intestino tenue dopo l'iniezione intramuscolare della nanoemulsione.

Cationic nanostructures have emerged as an adjuvant and antigen delivery system that enhances dendritic cell maturation, ROS generation, and antigen ...

Stiamo lavorando a un vaccino per mucosa che produca una risposta immunitaria come insieme di infezione, che ha il potenziale per prevenire l'infezione e interrompere la trasmissione. Abbiamo sviluppato un'immunizzazione catatonica con sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato con nanoemulsione catatonica con ovoalbumina mediante iniezione intramuscolare, che innesca risposte immunitarie sia sistemiche che mucose. In studi futuri, modelli animali di malattie correlate all'intestino possono essere utilizzati per valutare ulteriormente l'effetto e il meccanismo di un acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica nel migliorare la protezione del vaccino.

cationic-nanoemulsion-encapsulated-retinoic-acid-as-an-adjuvant-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cationic Nanoemulsion-Encapsulated Retinoic Acid as an Adjuvant to Promote OVA&#45;Specific Systemic and Mucosal Responses

371 Views.  Third Military Medical University. Stiamo lavorando a un vaccino per mucosa che produca una risposta immunitaria come insieme di infezione, che ha il potenziale per prevenire l'infezione e interrompere la trasmissione. Abbiamo sviluppato un'immunizzazione catatonica con sistema di rilascio di acido retinoico incapsulato con nanoemulsione catatonica con ovoalbumina mediante iniezione intramuscolare, che innesca risposte immunitarie sia sistemiche che mucose. In studi futuri, modelli animali di malattie correlate all'intestino p...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo e valutazione di un sistema di acido retinoico incapsulato con nanoemulsione cationica per la vaccinazione della mucosa