Gli enteroidi intestinali umani sono stati ottenuti dal laboratorio del Dr. Michael Helmrath presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Questo lavoro è stato supportato da R01 DK11005 (CIH) e dal finanziamento pilota del Cancer Center dell'Università di Cincinnati. Siamo grati per il supporto all'imaging da parte del Live Microscopy Core (NIH S10OD030402) dell'Università di Cincinnati.

Tutti gli esperimenti che utilizzano tessuti umani per la generazione di HIE sono stati approvati da un IRB presso il CCHMC (IRB#2014-0427). Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.
NOTA: Per illustrare la procedura descritta in questo protocollo, abbiamo utilizzato enteroidi intestinali umani (HIE) Bmal1-luc . Questi enteroidi sono stati sottoposti a trasduzione lentivirale stabile22 con il plasmide reporter pABpuro-BluF, che contiene il promotore Bmal1 fuso con la luciferasi, mostrando l'attività del promotore Bmal1 21.
1. Trasduzione lentivirale
<ol><li>Effettuare la trasduzione lentivirale22 in condizioni arricchite con cellule staminali per HIE. In particolare, garantire la formazione di sferoidi negli HIE entro 3-4 giorni dal passaggio nei mezzi di crescita intestinale, che crea condizioni arricchite di cellule staminali.</li>
	<li>Dopo la trasduzione lentivirale22, effettuare la selezione antibiotica con 2 μg/mL di puromicina, recuperare gli HIE resistenti alla puromicina e farli passare con una densità relativamente alta (cioè 1 pozzetto in 2 pozzetti) per 2-3x. Se il tasso di crescita degli HIE è lento, aggiungere 10 μM di inibitori ROCK (Y-27632) e 10 μM di inibitore GSK-3 (CHIR-99021) al terreno di crescita dell'organoide intestinale.</li>
</ol>2. Preparazione di organoidi per saggi di bioluminescenza
<ol><li>Giorno 1: Passaggio HIE a piatti rotondi da 35 mm.<ol><li>In breve, per l'espansione degli HIE, mescolare gli HIE con la matrice di coltura 3D a fattore di crescita ridotto (GFR) e seminarli su piastre a 24 pozzetti con tre goccioline da 10 μL di matrice di coltura 3D per pozzetto. Aggiungere 350 μl di terreno di coltura HIE e sostituirlo a giorni alterni. NOTA: La densità di HIE nella matrice di coltura 3D è fondamentale per la crescita degli enteroidi. Approssimativamente, il numero di sferoidi dovrebbe superare più di 50 in ogni gocciolina. Se il numero è basso, il tasso di crescita dell'HIE è influenzato negativamente.</li>
		<li>Quando gli HIE crescono a sufficienza (circa 7 giorni dopo il post-passaggio), raccoglierli da quattro pozzetti in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Lavare gli HIE con il PBS freddo utilizzando una mini centrifuga da banco (2.000 × g) per una centrifuga rapida di 40 secondi per rimuovere i detriti e l'eccessiva matrice di coltura 3D mediante pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 ml di PBS freddo nel pellet e applicare la turbolenza fisica siringando fino a 10 volte con una siringa da insulina da 1 ml per dissociare gli HIE.</li>
		<li>Centrifugare gli HIE dissociati con una mini centrifuga da banco come al punto 2.1.3 e rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta. Quindi, posizionare la provetta da microcentrifuga con il pellet HIE sul ghiaccio per farla raffreddare per circa 3 minuti.</li>
		<li>Aggiungere la matrice di coltura GFR 3D alla provetta della microcentrifuga e mescolarla con il pellet HIE. NOTA: Calcola la quantità della matrice di coltura 3D in base al numero di piatti rotondi da 35 mm che verranno utilizzati per l'esperimento. Generalmente seminiamo 30 μl di goccioline di matrice di coltura 3D per piatto rotondo.</li>
		<li>Seminare la miscela di HIE e la matrice di coltura 3D al centro della piastra rotonda da 35 mm e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti per solidificare la matrice di coltura 3D. NOTA: La densità degli HIE di semina deve essere determinata sperimentalmente. Sulla base dell'intensità della bioluminescenza, è possibile determinare il numero di HIE durante questo processo.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di terreno di crescita organoide intestinale preriscaldato a ciascuna piastra e incubare le piastre in un incubatore di CO2 fino alla fase successiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 3: Inizio della differenziazione<ol><li>Per avviare la differenziazione degli HIE, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato. NOTA: Vedere la Tabella 1 per le ricette dei mezzi di differenziazione HIE23.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 4: Non è richiesto alcun processo aggiuntivo.</li>
	<li>Giorno 5: Sostituire il terreno degli enteroidi con 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato.</li>
	<li>Giorno 6: Sincronizzazione dell'orologio e registrazione della bioluminescenza<ol><li>Per sincronizzare l'orologio molecolare degli enteroidi, aggiungere 2 μL di 100 μM di desametasone (Dex) per ottenere la concentrazione finale di 100 nM in ciascuna piastra e quindi incubare le piastre in un incubatore di CO2 (37 °C, 5% CO2) per 1 orae 24.</li>
		<li>Durante il ripristino Dex, preparare il luminometro in incubazione. Controllare la CO2 e la temperatura del luminometro in incubazione e impostarla rispettivamente al 5% e a 37 °C. NOTA: Si consiglia di pulire l'interno del luminometro in incubazione con alcol al 70% prima e dopo ogni utilizzo della macchina per mantenerla sterile.</li>
		<li>Dopo la sincronizzazione dell'orologio, ricaricare gli enteroidi con 3 mL di terreno di differenziazione preriscaldato contenente 200 μM di D-luciferina. NOTA: Poiché la luciferina è sensibile alla luce, il terreno contenente luciferina deve essere avvolto con un foglio e preriscaldato in un bagno di calore a 37 °C prima di applicarlo sul piatto.</li>
		<li>Posizionare le piastre in un tavolo a 8 pozzetti del luminometro in incubazione e coprire il tavolo della piastra campione con il coperchio. Posizionare due camere di umidificazione con fazzoletto umido o spugna sulla parte superiore del tavolo del piatto del campione. Si tratta di un processo una tantum. NOTA: Dopo l'inizio dell'esperimento, il coperchio del luminometro in incubazione deve essere tenuto chiuso fino al termine dell'esperimento. Assicurati di bagnare a sufficienza i fazzoletti/spugne.</li>
		<li>Chiudere il coperchio della macchina e avviare il programma per misurare la bioluminescenza per il numero di giorni e la risoluzione desiderati.<ol><li>Sul software, selezionare le impostazioni delle condizioni facendo clic sulla scheda Condizione e regolare le impostazioni su questo pannello: numero di piatti, tempo di misurazione, elaborazione in background e tipo di filtro. NOTA: Per questa dimostrazione, abbiamo selezionato tutte le parabole da A a H; tempo di misurazione predefinito, che è determinato dal software in base al numero di parabole; tempo di attesa per l'elaborazione in background e tipo di filtro F0. Poiché ci sono tre opzioni di filtro, tre colori luminescenti possono essere misurati contemporaneamente.</li>
			<li>Dopo aver immesso tutte le impostazioni appropriate in base all'esperimento, salvare le impostazioni facendo clic su OK.</li>
			<li>Per avviare l'esecuzione dell'esperimento, fare clic sulla scheda Esegui | Pulsante di avvio (icona a forma di triangolo verde). Osserva i dati come grezzi, filtrati dal rumore o detrendati effettuando le selezioni appropriate nella parte superiore dello schermo del software durante l'esecuzione degli esperimenti. Fare clic sulle schede Raw, Noise Filtered o Detrended per osservare i dati selezionati.</li>
			<li>Osservare i segnali per un massimo di 5 giorni. NOTA: Dopo 5 giorni di monitoraggio in un luminometro in incubazione, gli enteroidi possono iniziare a morire a causa dell'esaurimento del terreno. Per prevenire ogni possibile interruzione circadiana durante l'esperimento, non eseguiamo il cambio dei media per tutta la durata dell'esperimento.</li>
			<li>Al termine dell'esperimento, interrompi l'esecuzione facendo clic sul pulsante Interrompi (icona quadrata blu), vai alla scheda File e fai clic su Salva con nome. Salvare i dati in formato Kronos; esportare i dati in un foglio di calcolo nella sezione File facendo clic sull'opzione File e quindi selezionando Esporta in formato Excel sotto File per ulteriori analisi.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Ottimizzazione degli enteroidi intestinali umani per studi sul ritmo circadiano

<ol>
	<li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism.">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li><li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms:+Influence+on+physiology,+pharmacology,+and+therapeutic+interventions.">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li><li>Reppert, S., Weaver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li><li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li><li>Wolff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+age-dependent+and+tissue-specific+circadian+transcriptome+in+male+mice.">Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice.</a> Cell Rep. 42 (1), 111982 (2023).</li><li>Ruben, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+tissue-specific+rhythmically+expressed+human+genes+has+potential+applications+in+circadian+medicine.">A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine.</a> Science Trans Med. 10 (458), 8806 (2018).</li><li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions.">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416 (2021).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).</li><li>Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+destabilized+firefly+luciferase+enzyme+for+measurement+of+gene+expression.">Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression.</a> Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell-autonomous+circadian+clock+rhythms+of+gene+expression+using+luciferase+bioluminescence+reporters.">Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Lee, S., Hong, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+model+systems+to+investigate+circadian+clock-related+diseases+and+treatments.">Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments.</a> Front Genet. 13, 874288 (2022).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Rosselot, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+function+of+the+circadian+clock+in+intestinal+organoids.">Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids.</a> EMBO J. 41 (2), 106973 (2021).</li><li>Corr&#242;, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+organoids.">A brief history of organoids.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).</li><li>Brown, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+period+length+of+fibroblast+circadian+gene+expression+varies+widely+among+human+individuals.">The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals.</a> PLos Biol. 3 (10), e338 (2005).</li><li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids.">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> J Vis Exp. (98), e52531 (2015).</li><li>Criss, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drivers+of+transcriptional+variance+in+human+intestinal+epithelial+organoids.">Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids.</a> Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).</li><li>Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+circadian+gene+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures.</a> PLoS Comput Biol. 2 (10), e136 (2006).</li><li>Hara-Miyauchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+system+for+dynamic+imaging+of+cell+and+animal+behavior.">Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior.</a> Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroid+enhances+epithelial+barrier+function+in+intestinal+organoids+derived+from+patients+with+Chron's+disease.">Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease.</a> J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).</li><li>AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell-cell+communication+and+signaling+in+the+colorectal+cancer+microenvironment.">Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment.</a> Clin Transll Med. 11 (2), 308 (2021).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Il saggio di bioluminescenza offre diversi vantaggi per lo studio dei ritmi circadiani, che richiede la raccolta di dati da esperimenti a lungo termine. In primo luogo, consente ai ricercatori di monitorare l'espressione genica o la proteina di interesse mentre le cellule si muovono e proliferano. Senza apportare modifiche inutili o interrompere le funzioni delle cellule, gli eventi cellulari interessati o l'espressione genica possono essere registrati utilizzando la lettura della bioluminescenza, che fornisce dati affid...

Orologio circadiano Tutti gli organismi, dai batteri ai mammiferi, hanno una relazione complessa e dinamica con il loro ambiente. All'interno di questa relazione, l'adattamento ai cambiamenti ambientali è fondamentale per la sopravvivenza degli organismi. La maggior parte degli organismi possiede ritmi circadiani che consentono loro di adattarsi e ottimizzare le proprie funzioni a cicli diurni di circa 24 ore. L'orologio circadiano è una rete gerarchica di orologi centrali e periferici che lavorano in cooperazione per mantenere l'omeostasi fisiologica e mantenere gli organismi sincronizzati con i cambiamenti giornalieri 1,2. Nei mammiferi, l'orologio centrale o master situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) riceve segnali esterni, come la luce, e trasmette le informazioni agli orologi periferici attraverso un'interazione avanzata di vie di segnalazione neurali e umorali3. Oltre all'orologio centrale, i tessuti periferici possiedono un proprio meccanismo di orologio circadiano autonomo dalle cellule, mantenuto da un ciclo di feedback negativo trascrizionale-traduzionale (TTFL) che regola i geni controllati dall'orologio tessuto-specifici (CCGs)4,5. Questo macchinario molecolare produce una ritmicità di circa 24 ore in eventi cellulari e fisiologici, come espressioni geniche, vie di segnalazione, risposte immunitarie e digestione. L'orologio circadiano è presente in quasi tutte le cellule di mammifero ed è stato dimostrato che fino al 50% dei modelli di espressione dei geni mostra una ritmicità circadiana6. Considerando l'abbondanza di CCG, l'interruzione di questo meccanismo di clock può causare problemi fisiologici critici. Pertanto, le indagini sui ritmi circadiani sono necessarie per chiarire i meccanismi biologici essenziali e sviluppare nuove strategie terapeutiche.
Sistema reporter luciferasi Negli studi circadiani, il monitoraggio in tempo reale è fondamentale per una migliore comprensione dei comportamenti e delle risposte cellulari perché consente di tracciare i cambiamenti temporali nell'espressione genica e/o nei livelli proteici, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari regolati dall'orologio circadiano. Inoltre, il monitoraggio in tempo reale consente ai ricercatori di studiare gli effetti dei cambiamenti ambientali sui meccanismi molecolari 7,8. Esistono numerose tecniche per gli studi di monitoraggio in tempo reale, tra cui il saggio di bioluminescenza, ampiamente utilizzato per monitorare l'espressione genica o i livelli di proteine nel tempo. Il saggio di bioluminescenza è un metodo per rilevare i processi biologici utilizzando la produzione di luce come lettura. In questo saggio, un enzima ossidativo che produce bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) viene trasfettato transitoriamente o stabilmente nelle cellule di interesse e la lettura della bioluminescenza viene misurata in presenza di un substrato (ad esempio, luciferina) nel tempo. Ad esempio, l'enzima luciferasi produce bioluminescenza ossidando il substrato luciferina in presenza di ATP9. Grazie alla sua breve emivita, 3-4 oree 10 ore, la luciferasi delle lucciole è uno strumento potente per gli studi circadiani in termini di monitoraggio dinamico in tempo reale con rumore di fondo minimo 11,12,13. Per l'inserimento di DNA con un promotore marcato con luciferasi o un telaio di lettura aperto (ORF), il sistema di consegna genica lentivirale è un metodo affidabile che fornisce un'elevata efficacia di trasduzione, un'integrazione stabile e una bassa immunogenicità. La trasduzione stabile di un reporter bioluminescente fornisce un'espressione robusta nelle cellule in divisione e non in divisione, generando dati coerenti per gli studi circadiani14.
Organoide come modello Le tradizionali linee cellulari bidimensionali immortalizzate sono state determinanti in studi biologici che vanno dalla scoperta dei meccanismi molecolari fondamentali dei ritmi circadiani allo screening dei farmaci. Nonostante la convenienza dell'utilizzo di linee cellulari omogeneizzate, mancano di strutture multicellulari e interazioni intercellulari. Al contrario, gli organoidi sono strutture multicellulari "organiche" 3D in vitro che imitano la struttura degli organi in un piatto mostrando somiglianza con l'architettura dei tessuti in vivo e la multicellularità, inclusi i tipi di cellule staminali, progenitrici e differenziate15,16. Il possesso di caratteristiche di auto-organizzazione, multicellularità e funzionalità rende gli organoidi un notevole modello in vitro che rappresenta i processi cellulari e fisiologici che avvengono nei tessuti reali17. Diversi tipi di organoidi possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretta o cellule staminali adulte raccolte da vari organi, tra cui l'intestino tenue, il cervello, il fegato, il polmone e il rene18,19. Poiché le strutture degli organoidi possiedono un'architettura e una funzione simile a quella dei tessuti con la multicellularità e l'interazione dinamica cellula-cellula, sono superiori alle linee cellulari omogeneizzate per comprendere gli eventi cellulari che si verificano nei tessuti in vivo. Gli organoidi sono anche facilmente manipolabili e possono essere coltivati in condizioni controllate, il che li rende utili per gli studi circadiani20.
Lo scopo principale di questo lavoro è quello di introdurre un metodo di monitoraggio in tempo reale utilizzando un saggio di bioluminescenza specificamente studiato per lo studio dei ritmi circadiani in organoidi 3D multicellulari. Il monitoraggio in tempo reale degli eventi cellulari utilizzando una tecnica di saggio di bioluminescenza è stato ampiamente eseguito per colture cellulari prive della complessità multicellulare e delle comunicazioni intercellulari esistenti nei tessuti reali. Gli organoidi 3D offrono opportunità uniche per studiare le funzioni dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro. Ad esempio, si potrebbero studiare i ritmi circadiani negli organoidi con composizioni cellulari alterate o organoidi derivati da tessuti malati dei pazienti. Questo protocollo consente l'utilizzo di un saggio di bioluminescenza per studiare diversi aspetti dei ritmi circadiani in un modello in vitro fisiologicamente più rilevante, gli organoidi, che ci aiuterà a comprendere meglio i ruoli dei ritmi circadiani negli organi periferici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 x 10 Falcon tissue culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine IV Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1Bb</td>
			<td>Mfrn: BD 329424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (potassium salt)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I Human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced (GFR) Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kronos Dio Luminometer Machine</td>
			<td>ATTO Corporation</td>
			<td>AB-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pABpuro-BluF reporter plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring circadian oscillations with a bioluminescence reporter in organoids

La maggior parte degli organismi viventi possiede ritmi circadiani, che sono processi biologici che si verificano entro un periodo di circa 24 ore e regolano un repertorio diversificato di processi cellulari e fisiologici che vanno dai cicli sonno-veglia al metabolismo. Questo meccanismo dell'orologio trascina l'organismo in base ai cambiamenti ambientali e coordina la regolazione temporale degli eventi molecolari e fisiologici. In precedenza, è stato dimostrato che i ritmi circadiani autonomi vengono mantenuti anche a livello di singola cellula utilizzando linee cellulari come i fibroblasti NIH3T3, che sono stati determinanti per scoprire i meccanismi dei ritmi circadiani. Tuttavia, queste linee cellulari sono colture omogenee prive di multicellularità e di robuste comunicazioni intercellulari. Nell'ultimo decennio, è stato svolto un ampio lavoro sullo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di organoidi 3D, che sono sistemi multicellulari in vitro che assomigliano a strutture e funzioni morfologiche in vivo . Questo articolo descrive un protocollo per rilevare i ritmi circadiani utilizzando un reporter bioluminescente negli enteroidi intestinali umani, che consente lo studio dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro.

Circadian clock 
All organisms, from bacteria to mammals, have a complex and dynamic relationship with their environment. Within this relationship, adaptation to environmental changes is critical for the survival of organisms. Most organisms possess circadian rhythms that enable them to adapt and optimize their functions to diurnal cycles of approximately 24 h. The circadian clock is a hierarchical network of central and peripheral clocks that work in cooperation to maintain physiological homeostasis and keep organisms synchronized with daily changes1,2. In mammals, the central or master clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) receives external cues, such as light, and transmits the information to the peripheral clocks via an advanced interplay of neural and humoral signaling pathways3. In addition to the central clock, peripheral tissues possess their own cell-autonomous circadian clock mechanism, maintained by a transcriptional-translational negative feedback loop (TTFL) regulating tissue-specific clock-controlled genes (CCGs)4,5. This molecular machinery produces approximately 24 h rhythmicity in cellular and physiological events, such as gene expressions, signaling pathways, immune responses, and digestion. The circadian clock is present in almost all mammalian cells, and it has been demonstrated that up to 50% of the genes&#39; expression patterns exhibit circadian rhythmicity6. Considering the abundance of CCGs, disruption of this clock mechanism may result in critical physiological problems. Hence, investigations into circadian rhythms are necessary to elucidate essential biological mechanisms and develop novel therapeutic strategies.
Luciferase reporter system 
In circadian studies, real-time monitoring is critical for a better understanding of cellular behaviors and responses because it allows tracking of temporal changes in gene expression and/or protein levels, providing insights into the molecular mechanisms regulated by the circadian clock. Furthermore, real-time monitoring enables researchers to study the effects of environmental changes on molecular mechanisms7,8. There are numerous techniques for real-time monitoring studies, including bioluminescence assay, which is widely used to track gene expression or protein levels over time. Bioluminescence assay is a method to detect biological processes using light production as a readout. In this assay, an oxidative enzyme that produces bioluminescence (e.g., luciferase) is either transiently or stably transfected into cells of interest, and the bioluminescence readout is measured in the presence of a substrate (e.g., luciferin) over time. For example, the luciferase enzyme produces bioluminescence by oxidizing the substrate luciferin in the presence of ATP9. Due to its short half-life, 3-4 h10, firefly luciferase is a powerful tool for circadian studies in terms of providing real-time dynamic monitoring with minimal background noise11,12,13. For the insertion of DNA with a luciferase-tagged promoter or open reading frame (ORF), the lentiviral gene delivery system is a reliable method that provides high transduction efficacy, stable integration, and low immunogenicity. Stable transduction of a bioluminescent reporter provides robust expression in dividing and non-dividing cells, generating consistent data for circadian studies14.
Organoid as a model 
Traditional immortalized two-dimensional cell lines have been instrumental in biological studies ranging from uncovering fundamental molecular mechanisms of circadian rhythms to drug screening. Despite the convenience of utilizing homogenized cell lines, they lack multicellular structures and intercellular interactions. In contrast, organoids are in vitro 3D multicellular &#34;organ-like&#34; structures that mimic organ structure in a dish by displaying similarity to in vivo tissue architecture and multicellularity, including stem, progenitor, and differentiated cell types15,16. Possessing self-organization, multicellularity, and functionality features makes organoids a remarkable in vitro model representing the cellular and physiological processes occurring in real tissues17. Different types of organoids can be derived from pluripotent stem cells via directed differentiation or adult stem cells harvested from various organs, including the small intestine, brain, liver, lung, and kidney18,19. Since organoid structures possess a real tissue-like architecture and function with multicellularity and dynamic cell-to-cell interaction, they are superior to homogenized cell lines for understanding the cellular events occurring in in vivo tissues. Organoids are also easily manipulated and can be grown under controlled conditions, making them useful for circadian studies20.
The main purpose of this work is to introduce a real-time monitoring method utilizing a bioluminescence assay specifically tailored for studying circadian rhythms in multicellular 3D organoids. Real-time monitoring of cellular events using a bioluminescence assay technique has been widely performed for cell cultures lacking the multicellular complexity and intercellular communications that exist in real tissues. 3D organoids present unique opportunities to investigate the functions of circadian rhythms in multicellular systems in vitro. For example, one could investigate circadian rhythms in the organoids with altered cell compositions or organoids derived from patients&#39; diseased tissues. This protocol enables the utilization of a bioluminescence assay to investigate different aspects of circadian rhythms in a more physiologically relevant in vitro model, organoids, which will help us better understand the roles of circadian rhythms in peripheral organs.

Autore in primo piano: Indagini in vitro sui ritmi circadiani nei sistemi multicellulari

Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi

Our current scope of research is to investigate the roles of circadian rhythms in intestinal epithelial cell proliferation and differentiation. We are trying to determine whether the circadian clock regulates cell proliferation and differentiation from intestinal stem cells. This protocol presents a real-time monitoring method for circadian studies in three-dimensional organoids using a bioluminescence assay.Unlike performing bioluminescence assays in a conventional two-dimensional cell culture, this approach enables us to investigate circadian rhythms and their functions in a more physiologically relevant organoid model. Our findings show disrupted circadian rhythms in stem cell-enriched conditions while demonstrating robust circadian oscillations in differentiated human intestinal organoids, suggesting a remodeling of circadian clock machinery from stem cells to differentiated cells. Usages of patient-derived organoids with circadian bioluminescent reporters will help us advance our understanding of circadian rhythms in peripheral organs and different disease states.

La registrazione della bioluminescenza è stata condotta per valutare la ritmicità circadiana degli enteroidi intestinali umani (HIE) in due condizioni distinte: condizioni arricchite con cellule staminali utilizzando il terreno di crescita degli organoidi intestinali (Figura 3) rispetto alle condizioni che inducono la differenziazione, che è stata ottenuta sostituendo il mezzo di crescita degli organoidi intestinali con un mezzo di differenziazione. Il giorno dell'esperimento, abbiamo sin...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: In Vitro Investigations of Circadian Rhythms in Multicellular Systems at JoVE.com

I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Il nostro attuale scopo di ricerca è quello di indagare i ruoli dei ritmi circadiani nella proliferazione e differenziazione delle cellule epiteliali intestinali. Stiamo cercando di determinare se l'orologio circadiano regola la proliferazione e la differenziazione cellulare dalle cellule staminali intestinali. Questo protocollo presenta un metodo di monitoraggio in tempo reale per studi circadiani in organoidi tridimensionali utilizzando un saggio di bioluminescenza.A differenza dell'esecuzione di saggi di bioluminescenza in una coltura cellulare bidimensionale convenzionale, questo approccio ci consente di studiare i ritmi circadiani e le loro funzioni in un modello di organoide fisiologicamente più rilevante. I nostri risultati mostrano ritmi circadiani interrotti in condizioni arricchite con cellule staminali, dimostrando robuste oscillazioni circadiane in organoidi intestinali umani differenziati, suggerendo un rimodellamento del meccanismo dell'orologio circadiano dalle cellule staminali alle cellule differenziate. L'uso di organoidi derivati da pazienti con reporter circadiani bioluminescenti ci aiuterà a migliorare la nostra comprensione dei ritmi circadiani negli organi periferici e nei diversi stati patologici.

monitoring-circadian-oscillations-with-bioluminescence-reporter

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

703 Views.  University of Cincinnati College of Medicine. Il nostro attuale scopo di ricerca è quello di indagare i ruoli dei ritmi circadiani nella proliferazione e differenziazione delle cellule epiteliali intestinali. Stiamo cercando di determinare se l'orologio circadiano regola la proliferazione e la differenziazione cellulare dalle cellule staminali intestinali. Questo protocollo presenta un metodo di monitoraggio in tempo reale per studi circadiani in organoidi tridimensionali utilizzando un saggio di bioluminescenza.A differenza dell...

Video: Autore in primo piano: Indagini in vitro sui ritmi circadiani nei sistemi multicellulari

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.